Способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы

Способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ}ЯСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 300574 (21) 2028420/28-13 с присоединением заявки Ph (23) Приоритет (43) Опубликовано 05.03,78.Бюллетень 34 9

Союз Советских

Социалистических

Республик (l1) 5966 16 (51) М. Кл.

С 12 D 13/10

Гостдарстввнный номнтвт

Совета Мнннстров СССР па,долам наоврвтвннй н отнрытнв (53) УДК 577. 15. 663.

° 1 (088.8) (45) дата опубликования описания 150278 (72) Авторы изобретения

С.И.Безбородова, В.Г.Морозова, А.М.Безбородов и О.П.Белецкая

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР, 1) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ ГУАНИЛРИБОНУКЛЕАЗЫ

Изобретение относится к производству ферментон, в частности кристаллической гуанил-рибонуклеазы, используемой для расщепления рибонуклеиновых кислот белково-витаминных концентратов и в научных исследованиях для расшифровки структуры РНК.

Известен способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы Т« предусматривающий хроматографию препа- 10 рата, содержащего фермент, злю .ронание.фермента, повторную хроматографию, высалинание сульфатом аммония, освобождение от примесей и кристаллизацию фермента 11. l6

В качестве продуцента фермента в известном способе используют препарат порошкообразной така-диастаэы

Аэре g u& or 5 -"а т:.

Выход кристаллов рибонуклеазы ра- Ю нен 4,3t.

Недостатком известного способа является невысокий выход целевого продукта, сложнос-ь процесса за счет большого количества трудоемких степеней очистки и недостаточная чистота получаемой гуанил-рибонуклеазы.

Цель изобретения — разработка способа получения гуанил-специфичной рибонуклеазы грибов с использованием 30 отечественного продуцента, упрощение схемы очистки и повышение выхода целевого продукта.

Поставленн я цель достигается тем, что в предлагаемом способе получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы в качестве продуцента фермента используют Я эре гд1Р(ц 6 сРа ча 1и в вв 2654/4, а кристаллизацию осущестнляют диализом против кислого .разбавленного буфера .с последующей фильтрацией кристаллов, их растворением в буфере и повторной перекристаллизацией путем диализа.

Способ осуществляют следующим образом.

ГрИб h aye rg i Р Р и Э С1О та Ые та 2654/4 культивируют глубинно на комплексной питательной, среде, из фильтрата кульгуральной жидкости выделяют препарат фермента ° Эатем препарат, содержащий фермент, хроматографируют на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой н буфере с нейтральным рН. елее фермент элюируют N aCP. в исхо.. ном буфере, проводят повторную хроматографию в тех же условиях. Элюат, содержащий рибонуклеаэу, концентрируют высаливанием сульфатом .аммония или ультрафильтрацией и освобождают от примесей. Фермент кристаллизуют

596616

Формула изобретения

Составитель A.Áðàæíèêîâà

Техред О.Андрейко КорРектор С.Гарасиняк

Редактор О.Иванова

Заказ 1037/29 Тираж 568 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раутиская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 при диалиэе против кислого разбавленного буфера, кристаллы фильтруют и растворяют в буфере с РН 7,5 и затем проводят повторную перекристаллиэацию путем диализа.

Пример. Гриб A@per ß Ð0ïá

cFavatu6 Р 2654/4 выращивают глубинно в колбах на качалках при 190 об/мин и 25 С на среде следующего состава (в Ъ): глюкоза — 5,0, пелтон — 1,0, соевая мука — 0,5, М 04 7H 0 — 0,05, 0

СаС0 2Н О вЂ” О, 01, КНб — О, 2, Продол" жительность выращиванйя при посеве од односуточным инокулюмом 3-4 суток.

Иицелий отделяют фильтрованием, белки нативного раствора концентрируют высаливанием 0,9 насыщенным сульфатом аммония в 50-100 раэ (после осаждения проводят отделение осадка центрифугированием при 5000 g, растворяют рикаэу в 0,1 И буфере, РН 7,5 и удаля- 26 ют нерастворившийся осадок центрифугированием). Затем проводят хроматогра.фию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в буФере с нейтральным РН, элюцию проводят градиентом NaCE в исходном буфере. ц

Повторную хроматографию проводят в тех же условиях.:Элюат, содержащий рибонуклеазу, концентрируют с помощью высаливания сульфатом аммония или ультрафильтрацией, затем проводят гельО

Фильтрацию, на сефадексе (— 50,75 или 100) в буфере слабощелочйого РН.

Фермент кристаллизуют при диализе против кислого разбавленного буфера, кристаллы отфильтровывают и растворяют в буфере с РН 7,5, затем перекристаллизовывают при тех же условиях.

Предлагаемый способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы позволяет при использовании отечественного продуцента повысить выход и чистоту целевого продукта, который может быть применен при изучении структуры РНК и белка и механизма действия рибонуклеазы.

Способ получения кристаллической гуанил-рибонуклеазы, предусматривающий культивирование ее продуцента на питательной среде, выделение фермента из Фильтрата культуральной жидкости, хроматографию пРепарата, содержащего фермент, элюирование фермента, повторную хроматографию,.высаливание сульфатом аммония, освобождение от примесей и кристаллизацию фермента, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, в качестве продуцента фермента используют Aeyevgi E(ue сРаъ а tu б

9 2654/4, а кристаллизацию осуществляют диализом против кислого разбавленного буфера с последующей фильтрацией кристаллов, их растворением в буфере повторной перекристаллизацией путем диализа.

Источники информации, принятые во. внимание при экспертизе:

1. Mlita to С уь|а И i ea Ron о1 2 ibonve1еаье )," Joî íà3 о1 В осйе rviь1 у

Р 5, 59, 1966, р, 443-448.