Способ биочинтеза биологически активного вещества

Способ биочинтеза биологически активного вещества

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП И "Н И Е

1Щ 600I75

Союз Советских

Социалистических

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Республик (61) Дополнительное к авт. с13n I-в1 (22) Заявлено 01.08.76 (21) 2391670/28-13 (51) Ч. Кл."- С 12Р 13/10 с присоединением заявки ¹

Государственный комитет

Совета Министров СССР (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.03.78. Бюллетень ¹ 12 (45) Дата опубликования описания 28.03.78 (53) УДК 576.8(088.8) по делам изобретений н открытий (72) Авторы изобретения

В. А. Кордюм и С. И. Черных (71) Заявитель Институт молекулярной биологии и генетики АН Украинской ССР (54) СПОСОБ БИОСИНТЕЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО

ВЕЩЕСТВА

Изобретение относится к вопросам получения ферментных препаратов, например р-галактозидазы, из микроорганизмов, касается способа биосинтеза биологически активных веществ и может найти широкое применение в пищевой промышленности, связанной с переработкой молока и отходов молочной промышленности, а также для медицинских целей.

Известны способы биосинтеза биологически активных веществ, а именно Р-галактозидазы (лактаза, P — D-галактозидгалактогидролаза

K. Ф. 3.2.1.23), которая расщепляет молочный сахар (чактозу) до глюкозы и галактозы.

Выявлены активные продуценты р-галактозидазы, среди них культура дрожжей Fabospora fragilis(II 100 мл среды образовывалось

150 — 350 ед. фермента, в 1 r сухих дрожжсй— до 200 ед), Escherichia coli, выделенная из колибактерина (в 100 мл среды образовывалось до 40 единиц Р-галактозидазы, а в 1 г бактерий — до 540 ед, фермента). Существуют и другие штаммы.

Однако такие штаммы для осуществления суперсинтеза настолько требовательны к условиям культивирования (хемостатныс, выращенные при низких плотностях популяции), что они не нашли применения в промышленности.

В подавляющем большинстве случаев для получения максимального выхода продукта осу|цсствляют спсциальную параметрическую или ш|дивидуальную регуляцию процесса биосинтеза.

Известен более эффективный способ oIIocIInтеза биологически активного вещества, согласно которому биосинтез регулируется информационно путем введения в заданный момент экзогенной информации, т. с. смешения культуры-продуцента с носителем информации.

1О Если, согласно известному способу, чувствительныс бактерии заразить бактериофагом, несущим информацию на синтез данного продукта, то в течение короткого времени происходит колоссальное увеличение этого вещест15 ва, достигающее тысячекратных значений.

Такой способ биосинтсза обеспечивает резкое увеличение выхода продукта. Однако прн этом возникают и существенные технологические осложнения, связанные с дополнительной

2о нараооткой информационного начала (в данном случае бактсриофага). Это сопряжено со значительными техническими трудностями, настолько большими, что способ практически становится неосущсствимым.

IJ<лью изобретения является повышение выхода конечного продукта при одновременном упрсщснпи процесса.

Для этого в качестве носителя информации

ЗО используют лизогенную культуру, при этом

600175

Формула изобретения

Соста итель М. Андреева

Техред И. Михайлова

Корректоры; Л. Денискина и Е. Мохова

Редактор М. Дмитриева

Подписное

3.аказ 264/14 Изд. ¹ 314 Тираж 568

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская паб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 последнюю перед смешиванием с культуройпродуцснтом подвергают прогреву.

Предлагаемый способ заключается в следующем. Продуцент информации, в данном случае лизогенную культуру — штамм Escherichia coli СА 5013 А р1асзС1857, в начале выращивают при 30 С, охлаждают до 4 — 6 С и проводят термоиндукцию при 42 — 43 С в течение 20 мин. Затем лизогенную культуру сразу после термоиндукции смешивают с рециписнтным штаммом. Реципиентом в данном случае является восприимчивый к фагу. штамм

Escherichia coli, например штамм Escherichia

coli АВ 259 Н(г3000. Смешивают лизогепну10 культуру после термоиндукции и рсциппснтную к> льтуру в соотношении 1: 3 — 1: 30, послс чего продолжают инкубацию прп

37 С в условиях сильной аэрации до прекращения бносинтеза фермента. После окончания процесса активность 1з-галактозидазы в лизатс достигает до 10000 единиц. Установлено, что если на одну клетку Escherichia coli приходится 1 фаговая корпускула, то 13-галактозидазная активность в 5 — 10 раз меньше по сравнению с активностью, которая получается при уменьшении количества фага в 5 — 10 раз.

Это связано с тем, что в то время, когда фаг развивается в части клеток, другая часть незараженных клеток продолжает расти и размножаться и к моменту созревания и выхода из клеток новой порции фаговых корпускул для него имеется новая порция молоды.; клеток, которые заражаются фагом. Так проходит несколько циклов, в результате которых и накапливается 1з-галактозидаза.

По предлагаемому способу получают 15—

18 мг белка Р-галактозидазы в 1 л лизата или

10000 единиц фермента в 1 мл лизата. Пересчет единиц активности 8-галактозидазы на количество белка фермента ведут на основании данных, приведенных в работе Робинсона (HiotechrI. bioeng., 1974, № 16, с. 1103).

Обе культуры выращивают в среде ампнопептид с 0,14 М NaC1 в соотношении 1: 1. Такая среда является оптимальной по сравнению с другимп исследованными питательными средами.

Полученное соотношение смешивания лнзогснной и рсцнпиентной культур в соотношениях 1: 3 — 1: 30 является предпочтительным по сравнению с иными соотношениями, так как при этом происходит максимальный биосинтез фермента. Согласно вышеприведенным данным можно сделать вывод, что показатели результатов синтеза по предлагаемому способу во много раз превышают уровень синтеза существующих ныне промышленных продуцентов р-галактозидазы, для которых описано получение всего лишь десятков единиц фермента.

Г! р и м е р. Лизогенную культуру- — штамм

1 scherichia coli СА 5013 л рlас5 С1857 выращивают на среде аминопсптид с 0,14 М NaCI в cooTHOIIIcHIIH 1: 1 при 30 С до плотности

1к,10" клеток в 1 мл. Затем культуру охлаждают до 4 — 6 С и проводят термоиндукцию лизогенной культуры при 42 — 43 С в течение

20 мин. К этому времени выращивают культуру-продуцент Escherichia coli АВ 259 Hfr

3000 на среде аминопептид с 0,14 М NaCl в соотношении 1: 1 при 37 С до плотности

1к,1Оз клеток в 1 мл и смешивают с термоиндуцированной лизогенной культурой в соотношении 10: 1.Процесс продолжают вести при

37 С в течение 18 и. 3а это время в 1 мл культуральной среды накапливается 10000—

15000 единиц фермента (по Парди, )Какобу и

Моно), это соответствует 15 — 18 мг белка (галактозпдазы в 1 л лизата.

1. Способ биосинтеза биологически активного вещества, предусматривающий смешивание культуры-продуцента с носителем информа4() ции, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и упрощения процесса получения целевого продукта, в качестве носителя информации используют лизогенную культуру, при этом последнюю перед смешиванием с

45 культурой-продуцентом подвергают прогреву.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что прогрев проводят в интервале 40 45 С.