Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы

Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик о и и с-Я тгУГ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

> 6OI286 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 26.04.76 (21) 2351921/04 с присоединением заявки 1че— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 05.04.78. Бюллетень No 13 (45) Дата опу бликсвания,описания 20.04.78 (51) М Кл С 07 6 7/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР иа делам изобретений и открытий (53) УДК. 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. Л. Яровенко, А. К. Овчаров, Н. В. Голубева, Л. В. Римарева, С. В. Рогожин, Ю. А. Давидович, С. М. Андреев и Б. А. Устинников (71) Заявители

Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения и ордена Ленина институт элементоорганических соединений АН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ

Настоящее изобретение относится к способу получения нерастворимых ферментных препаратов, а именно к способу .получения и ммобилизованных препаратов фермента,глюкоамилазы (КФ 3.2.1.1), который широко применяется в промышленности. Этот фермент используют для получения глюкозы из крахмалсодержащего сырья с целью последующего выделения из гидролизатов кристаллической глюкозы. Глюкоамилаза используется также в производстве пи ва, спирта и некоторых других продуктов. Внедрение в промышленность препаратов иммобилизованной глюкоамилазы приведет к существенному снижению экономических затрат.

15 ,В качестве полимерных матриц и неорганических носителей широко используют ионообменную целлюлозу и различные активированные редкоземельными металлами и активированные химически подложки из керамических материалов (1).

Основной недостаток указанных способэв получения иммобилизованной глюкоамилазы заключается в том, что получаемые препараты обладают малой механической прочностью и высоким гидравлическим сопротивлением при использовании их в реакторах колонного типа. При использовании в качестве матрицы .ио нообменной целлюлозы, препараты глюкоамилазы подвергаются микробиологическому Зо разрушению и заражению, а керамические матрицы активированы дорогостоящими редкоземельными металлами (Zv, Ti и др.). Общий недостаток указанных способов заключается в низкой удельной активности препаратов глюкоамилазы и в многоэтапности осуществления процесса иммобилизации.

Из известных способов получения HMMQбилизованной глюкоамилазы по технической сути и достигаемым результатам к настоящему изобретению наиболее близким является способ получения иммобилизованной глюкоамилазы путем конденсации фермента с частицами анионного г1тдрофильного геля (2).

Однако этот способ обладает рядом существенных недостатков. Частицы геля стабильчы только при рН 6,0,реакционной среды и выше, при более низких значениях рН гранулы сжимаются и происходит значительная потеря их активности. Субстраты и конечные продукты ферментативной реакции должны быть в,нейтральной или анионной форме. Кислые продукты реакции адсорбируются на анионной матрице и значительно ингибируют катализ.

Необходимо отметить, что в указанном способе получения иммобилизо ванных ферментов за счет тройной сополимеризации частицы анионного гидрофильного геля имеют неупорядоченную структуру, что значительно

601286 пользования сополимера как в транулированном виде, так и в армированном состоянии или в виде покрытий значительно расширяет области применения полученного препарата.

Hip и м ер 1. К 100 г сололимера малеинового ангидрида и N-винилпирролидона, растворенного в 500 мл диметилформамида, igo10 бавляют 5 г 5 мол. /, 4,4-диаминоди фенилоксида, растворенного в 50 мл диметилформамида, быстро размешивают, и в раствор вносят армирующую подложку (капроновую ткань), и выдерживают .в течение 1 — 2 мин.

Затем армированный сополимер высушивают в вакууме при 120 С. К полученному армированному соцолимеру добавляют 1000 мл ультраконцентрата культуральной жидкости

I=nd. bispora и выдерживают в течение двух суток при комнатной температуре. Затем иммобилизованную глюкоамилазу на армированном сополимере промывают водой и высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность составляет

3700 — 3900 ед, г сополимера. Выход по активности составляет 60 — 7IOO/0 от исходной.

П р и м eip 2. К 100 г сополимера малеинового ангидрида:и N-винилпирролидона, рас— творенного в 500 мл диметилформамида, добавляют 5 г 5 мол /о 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 50 мл диметилформамида,,быстро размешивают и в,раствор вносят армирующую подложку (капроновую ткань), и выдерживают в течение 1 — 2 мин.

35 Зате. армир .анный сополи р высушивают в вакууме при 120 С. К полученному армированному сополимеру добавляют 1000 мл ультраконцентрата глюкоамил азы, разбавленного в 2 раза (15 /, сухих веществ), и выдер40 живают при ко атной температу ре в течение двух суток. Глюкоамилазная активность составляет 4100 — 4300 ед г сополимера. Выход по активности составляет около 90 — 95% от исходной.

Пример 3. К 100 г сополимера малеинового ангидрида и N-винилпирролидона, растворенного,в 200 мл диметилформамида, добавляют 3,82 г 4 мол. /о 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 20 мл диметилфор,м амида. Полученный гомогенный раствор приливают п ри постоянном перемешивании к

3000 мл полиэтилсилоксановой жидкости (типа ПЭС-5). Образовавшуюся эмульсию нагревают при перемешивании в течение двух часов при 80 С. Полученные сферические гранулы отфильтровывают, промывают 4ОО мл ацетона, смесью уксусного ангидрида с диметилформамидом (2: 1) в количестве 300 мл, 4ОО мл ацетона, 400 мл серного эфира и высубО

65 снижает емкость матрицы по каталитически активному белку. По приведенным авторами данным гель состоит из 67.мэл. /о акриламида, 32 мол. /, ангидрида метакриловой кислоты со сшивкой 0,5 — 1,0 мол. /о N,N-метилен-бисметакриламидом или этиленгликольметакрилатом. Низкая степень сшивки приводит .к получению сильно набухающего геля, частицы которого, имеют очень низкую механическую

7р очность.

Цель оп исываемого способа заключается в устранении недостатков известного способа и получении препаратов иммобилизованной глюкоамилазы с высокой активностью при достаточно высоком выходе .по глюкоамилаз:ной активности. Указанная цель. достигается за счет того, что la качестве нерастворимой подложки используют полимерные матрицы, синтезированные на основе малеинового ангидрида и,гидрофильных сополимеров.

Необходимо отметить, что высокая адгезия гидр офильных сополимеров позволяет получать их как в виде армированной пленки (в качестве армирующего материала могут быть использованы синтетические ткани, металлическая сетка, гранулы инертного материала и т. л.), так и в гранулированном виде без .армирующего материала.

Наиболее перспективной полимерной ыатрицей для мобилизации глюкоамилазы является чередующийся сочолимер малеиновогп ангидрида и М-винилпирролидона. В качестве гидрофильных сомономеров можно иcïînüçовать также акриловую и метаириловую кислоты, акриламид, Х-винилпиридин. В качестве сшивающих агентов можно использовать этиловый эфир лизина и 4,4-диаминоди фенилс ксип,.

Согласно изобретению описывается способ получения препаратов иммобилизованной глюкоамилазы посредством конденсации фермента с полимерной матрицей, в качестве которой используют сîlIoëHìåðû малеинового ангидрида с гидро фильными сомономерами в

=шитом виде. ,Процесс проводят следующим образом.

К сополимеру малеинового антидрида с гидрофильны ми сомономерами, растворенному в апротонном растворителе (диметил формамиде или его смеси с а цетоном), добавляют сши«ающий агент .в конц ентра ции 2 — 10 мол. /о, растворенный в апротонном растворителе, например диметилформамиде, и получают сшитый сîполимер в .виде грабанул,или,в армированном виде (в случае внесения армирующей подложки). Сшитый сополимер промывают ацетоном, спиртом и эфиром и высушивают в вакууме при 120 С. Полученный сополимер вводят во взаимодействие с ультраконцентратом культуральной жидкости End. bispora.

Процесс иммобилизации проводят в течение о дних-двух суток при комнатной температуре при перемешивании.

Предполагаемый способ позволяет получать нерастворимые препараты глюкоамилазы, обладающие высокой удельнои активностью и большим выходом, а возможность исшивают в вакууме при 120 С. Выход составляет 100 г (100%) сферических гранул днам етр о м 0,2 — 0,5 мм.

К 100 г полученного гранулираванного сополиме ра приливают 800 мл ультраконцентрата глюкоамилазы. Реакционную смесь вы601286

65 держивают в течение суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

Препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтрэвывают и тщательно промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на белок с 20 раствором салициловой кислоты. Полученный препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре.

Глюкоамилазная активность полученного п ре парата составляет 4200 — 4500 ед, г сополимера..Выхсд по активности "отазляет 65—

7 50/0 от исходной.

Пример 4. 50 г сополимера малеинового ангидрида и акриловой кислоты растворяют в 50 м г смеси ацетона и диметилформамида (1: 1) при .",эстоянном,перемешивании и добавляют 1,91 г 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 10 мл диметилформамида, вливают при .постоянном перемешивании в

2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости (типа ПЭС-5) . Ооразовавшуюся эмульсию нагревают.на масляной бане,з течение 4 часов при бб С. Полученные гранулы отфильтровывают, промывают 400 мл эфира, 400 мл ацетона и снова 400 мл эфира и затем высушивают в вакууме при 120 С. Выход составил 50 г сферических гранул диаметром 0,2 — 0,4 мм.

К 50 г полученного гранулированного сополимера гмалеинового ангидрида и акриловой кислоты добавляют 40О мл ультраконцентрата тлюкоамилазы и вь|держивают в течение одних суток,при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Затем препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на белок. Полученный препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата составляет 4400 — 4600 ед/г сополимера. Выход по активности составляет около

320/0 от исходной.

Пример 5. 50 г сополимера малеинового ангидрида .и метакрилозэй кислоты ра:твэ ряют в 50 мл ацетона при постоянном перемешивании и добавляют 1,91 г 4,4-1диаминодифенилоксида, растворенного в 10 мл диметилформамида. Раствор сополимера при перемегцивании вливают в 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости. Образовавшуюся эмульсию угри,перемешивании нагревают при 56 С в течение 5 часов. Полученные гранулы отфильтровывают и тщательно промывают 500 мл ацетона и 500 мл эфира и высушивают в вакууме,при 120 С. Выход составляет 50 г сферических гранул диаметром около 0,3—

0,6 мм.

К 50 г полученного сополимера малеинового ангидрида и метакриловой кислоты добавляют 400 мл ультраконцентрата глюкоамилазы. Смесь выдерживают при комнатной температуре и перемешивании в течение суток. Препарат глюкоамилазы отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой до отсутствия реакции,на белок. Полу5

50 ченный препарат высушивают в за куузе при ксмнатнэй температуре. Глюкоамилазная активчость полученного препарата составляет

4800 ед г сополимера. Выход по активности соста зляет 56% от исходной.

Пример б. 50 г сополимера малеинового ангидрида и акриламида растворяют в

400 мл ацетона и добавляют 50 мл диметилформамида. В реакционную смесь при постоянном перемешивании вливают раствор 4,4диаминодифенилоксида в диметилформамиде — 1,92 г в 10 мл и выдерживают при температуре 56 С в течение 40 мин. К реакционной сиеси добавляют 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости. Образовавшуюся эмульсию при постоянном перемешивании выдерживают,з течение 40 мин при 56 С. Полученные гранулы отфильтровывают .и тщательно промывают серным эфиром (500 игл) и ацетонэм (500 м,г). Затем гранулы сушат в пистолете Фишера над пятиокисью фосфора.

К 50 г полученного гранулированного сополимера малеинового ангидрида I1 акриламида добавляют 800 мл ультраконцентрата глюкэамилазы. Реакцслонную смесь .выдерживают в течение суток при постоянном перемешизании и комнатной температуре. Препарат пммэбилизованной глюкоамплазы отфильтровызают и тщательно промывают водой до нейтральной реакции на белок. Препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата составляет 3500 — 3700 ед/г сополимера. Выход по активности составляет около 60 /0 от исходной.

Пример 7. 50 г сополимера малеинового ангидрида и N-винилппридина растворяют в 50 мл диметилформамида при постоянном перемешивании и добавляют 1,91 г 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 10 лг г диметилформамида. Раствор сополимера вливают при интенсивном перемешивании в

2000 мл Iолиэтилсилоксановой жидкости.

Эмульсию при интенсивном перемешивании выдерживают з течение 3 часэв при температуре 80 С. Гранулы сшитого сополимера отфильтровывают и промывают 5СО мл серного эфира и 500 мл ацетона. Затем полученные сферические гранулы высушивают в вакууме при 120 С.

К 50 г полученного гранулированного спполимера малеинового ангидрида и N-винилпиридина добавляют 600 мл ультраконцентрата глюкоамил азы и реакционную смесь выдерживают в течение суток при постоянном перемешивании и .комнатной температуре. Препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтро зывают и промывают водой до отрицательной реакции на белок. Препарат высушивают в вакууме .при комнатной температуре. Глюкоамила3Hая активность полученного препарата составляет 3100—

3300 ед/г сополимера. Выход по актлзности составляет около 50 /0 от исходной.

Составитель А, Бочаров

Текред И. Рыбкина

Редактор Н. Арванцова

Корректоры В. Гутман и И. Симкина

Заказ 118/2j7 Изд. № 119 Тираж 568

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Тип. Харьк, фил. пред. «Патент»

Пример 8. 46 г сополимера,малеинового ангидрида и N-винилпирролидона растворяют в 5 мл диметилформамида и к раствору добавляют 4,36 г этилового э фира лизина и 7,18 г уксуснокислого натрия, растворенных в 6 л1л диметилформамида. Однородную массу при интенсивном перемешивании приливают к 1. 200 л л полиэтилсилоксановой жидкости и нагревают при температуре 75 С в течение

2 часов. Полученный сшитый сополимер отфильтровывают, промывают 500 мл ацетона, 500 мл этанола и 500 мл эфира. Полученный препарат высушивают в вакууме при 120 С.

К 50 г сополимера малеинового ангидрида и N-винил пирролидона, сшитого лизином, приливают 800 мл ультраконцентрата тлюкоамилазы и выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Полученный препарат глюкоамилазы отфильтровьгвают и промывают водой до нейтральной, реакции на белок, а затем высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата глюкоамил азы составляет 6000 — 6100 ед/г сополимера, Выход по активности составляет 80 — 85о о от исходной.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы путем конденсации фермента с полимерной матрицей, отличающийся тем, что, с целью повышения активности препаратов, в качестве полимерной матрицы используют сополимеры малеинового ангидрида с гидро|фильными сомономерами в сшитом виде.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем,, что в качестве гидрофильного сомономера используют N-винилпирролидон.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем,.

5 что в качестве гидрс фильного сомономера используют акриловую кислоту.

4. Способ по п. 1, отличающ,яйся тем, что в качестве гидрофильного сомономера используют метакриловую .кислоту.

10 5. Способ по п. 1, отличающийся тем,. что в качестве гидро фильного еомономера используют акриламид.

6. Способ по п. 1, о тл ич а ющий ся тем,. что в качестве гидрофильного сомономера ис15 пользуют N-винилпиридин.

7. Способ по пп. 1 —.6, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют 4,4-диаминодифенилоксид.

8. Способ по пп. 1 — 6, о тл и ч а ющ ий ся.

2о тем, что в качестве сшивающего агента используют этиловый эфир лизина.

9. Способ по пп. 7 и 8 отличающийся тем, что сшивающие агенты .используют в концентрации 2 — 10 мол. о о.

25 1 О. Спосо,б по пп. 1 — 6, о тл и ч а ющий ся тем, что используют сополимеры, структурированные в виде гранул или в виде армированной пленки.

80 Источники:информации, принятые во,внимание при экспертизе:

1. Березин И, Н., Антонов В. К., Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. М., изд.

МГУ, 1976, т. 2, с. 121, 282.

85 2. D. М. Кгагпег et al., 1. Polymer Sci, Sym-posium, 1974, № 47, с. 77 — 87, 89 — 94.