Способ получения лизирующих ферментов

Способ получения лизирующих ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ьоавго

Союэ Советских

Социал истйческих

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 21.04.76 (21) 2340422/28-13 с присоединением заявки № (51) М. Кл.а С 12D 13/10

Государственный комитет (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.04.78. Бюллетень № 16 (53) УДК 577.15(088.8) (45) Дата опубликования описания 03,05.78

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения (71) Заявители

Г. И. Петров, Е. П. Савельев, 3. Ф. Рахманова и В. Д. Кузнецов

Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков и Первый Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени медицинский институт им. И. М. Сеченова (54) СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗИРУ1ОЩИХ ФЕРМЕНТОВ

1

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам получения ферментов, лизирующих гемолитический стрептококк группы А.

Лизирующие ферменты могут быть использованы для выделения и изучения изолированных антигенов стрептококка группы А в нативном состоянии. Кроме того, эти ферменты могут быть использованы для лечения таких заболеваний человека, как ангина, скарлатина, ревматизм, гломерулонефрит, острые респираторные заболевания верхних дыхательных путей и легких, рожи и др., а также в борьбе с носительством указанного возбудителя среди здоровых.

Известен способ получения лизирующих ферментов путем культивирования микроорганизмов рода Actinomyces на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и,последующего выделения ферментов {1).

Недостатком известного способа является получение целевого продукта со значительным количеством трудноотделимых примесей протеолитических ферментов, оказывающих воздействие на иммуногенные белки, в связи с чем данный комплекс ферментов не может быть использован для получения специфичес к их а нт и с ы вор ото к.

Целью настоящего изобретения является по2 лучение ферментов, лизирующих стрептококк группы А без разрушения стрептококковых антигенов.

Для достижения поставленной цели из мик5 роорганизмов рода Actinomyces используют:

Actinomyces levoris 692

Act nomyces levor з 67

Actinomyces levoris G4

Actinomyces levoris 95

10 Actinomyces levoris 109

Actinomyces griseolus 88

Actinomyces albofavus 194

Actinomyces griseochromogenes 275

Actinomyces odorifer 406

15 Actinomyces streptomycini 83

Actinomyces сегена 187

Actinomyces albus 454

Actinomyces species 492

Actinomyccs species 161

Сущность предлагаемого способа получения лизирующих ферментов заключается в том, что перечисленные штаммы актиномицетов культивируют на среде, содержащей источник

25 углерода, азота и минеральные соли, Предпочтительными являются питательные среды состава, %:

I. Казеиновый гидролизат 0,1 — 0,8

Глюкоза 0,2 — 1,6

30 Хлористый натрий 0,2 — 0,7

604870

0,40

0,50

0,30

Фосфорнокислый калий двузамещенный 0,1 — 0,5

II. Кукурузная мука 0,5 — 5,0

Соевая мука 1,0 — 8,0

Фосфорнокислый калий двузамещенный 0,1 — 1,0

Хлористый натрий 0,1 — 0,7

Цинк сернокислый 0,0001 — 0,001

Выделение ферментов, лизирующих стрептококк группы А, осуществляют препаративным электрофокусированием в градиенте рН от 2 до 10 с последующим освобождением от амфолинов гельфильтрацией на Сефадексе

G-25.

Пример 1. Конические колбы емкостью

750 мл заполняют 100 мл жидкой питательной среды следующего состава, %.

Казеиновый гидролизат

Хлористый натрий

Глюкоза

Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,15

Вода водопроводная До 100 рН среды 7,2. Колбы инокулируют водной суспензией спор Actinomyces levoris б92, выращенного в течение 14-ти суток при 28"С на агаризованной питательной среде с кукурузным экстрактом.

После освобождения культуральной жидкости от мицелия центрифугированием (10 000 g, 10 мин) ферменты осаждают в течение ночи при 4 С сульфатом аммония (70% насыщения). Образовавшийся осадок центрифугирутю на рефрижераторной центрифуге (10000 д;

10 мин, 4"С). Гlолученный осадок белков растворяют в 1 — 2 мл холодного 0,02М бикарбонатного буфера и проводят обессоливание гельфильтрацией на Сефадексе G-25. Осадок растворяют в 1 мл 0,82 iv1 бикарбонатного буфера и хроматографируют на диэтиламиноэтилцеллюлозе (хроматографическая колонка

2,5X30). Получают активную фракцию, содержащую ферменты, которую лиофильно высушивают и определяют литическую активность. ,11итическая активность Actinomyces levoris б92 составляет 85% при экспозиции 1 ч и 91 /о при экспозиции 4 ч.

Пр имер 2. Конические колбы емкостью

750 мл заполняют 100 мл жидкой питательной среды следующего состава, "/о ..

Кукурузная мука 1,000

Соевая мука 2,000

Калий фосфорнокпслый двузамещенный 0,200

Натрий хлористый 0,500

Цинк сернокислый 0,001

Вода водопроводная До 100

Колбы инокулируют 5% по объему двухсуточного вегетативного мицелия Actin omyces

levoris б7, выращенного на кукурузной среде в колбах на круговых качалках при скорости

220 — 250 об/мин и температуре 28"С.

После освобождения культуральной жидкости от мицелия центрифугиронанием (10000 g, 10 мин) ферменты осаждают в течелице культуры депонированы в коллекции

35 культур ВНИИА под соответствующими регистрационными номерами.

Литическая активность (i) при экспозиции ч

АсИпотусез

1 2 № 692 № 67 № 64 № 95 № 109 № 88 № 194 № 275

82

61

54

76

77

61

53

52

52

83

91,0

90,0

78,0

71,0

67,0

87,0

82,0

84,0

81,0

68,0

67,0

65,5

93,0

81,0

1ечот!з

levoris

levoris

levoris

levoris

griscolus а1Ьойачаз

griseochromogenes

odorifer № 406

¹ 83

streptomycini

citreus

albus

¹ 187

¹ 454 № 492

¹ 161

sp.

sp.

Полученные ферменты обладают высокой активностью, специфичностью и стабильностью. Они использованы для выделения и изу65 чения нативных антигенов стрептококка груп4 ние ночи при 4 С сульфатом аммония при насыщении 70 . Осадок центрифугируют на рефрижераторной центрифуге (10 000 g, 10 мин, 4 С) .

Осадок белков растворяют в 1 — 2 мл

0,02 М бикарбонатного буфера, Для окончательной очистки ферментов проводят препаративное электрофокусирование в градиенте рН от 2 до 10. Полученную фракцию, содер10 жащую фермент (рН 9,3), освобождают or амфолинов гельфильтрацией на Сефадексе

G-25. Активную фракцию, содержащую фер-, менты, лиофильно высушивают и определяют литическую активность Actinomyces levoris 67, которая при экспозиции 1 ч составляет 82%.

Для определения лизирующей активности используют суспензию клеток стрептококка группы А, тип 29 (штамм Д-23/11, ¹b2/59—

Гlражская коллекция). Реакционная смесь для

20 определения активности лизирующих ферментов содержит 1,0 мл суспендированных клеток стрептококка в 0,075 M (рН 7,б) фосфатном буфере и 2 мл раствора фермента в том же буфере (100 — 150 мкг).

25 Об активности ферментов судят по изменению оптической плотности реакционной среды при б50 им (температура 37 С, экспозиция 1 и

4 ч), которую выражают в процентах. Исходную оптическую плотность реакционной смеси

30 (0,5 — 0,7 о. е.) принимают за нулевую точку.

В таблице приведены данные по лизирующей активности ферментов, выделенных из культур актиномицетов. Все указанные в таб604870

Формула изобретения

Составитель T. Серебренникова

Редактор Н. Хубларова Техред Н. Рыбкина Корректор А. Степанова

Заказ 676/9 Изд, г1в 421 Тираж 568

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

5 пы А. Антигены, полученные при помощи этих ферментов в соответствии с настоящим изобретением, имеют следующие преимущества: сохраняют нативную структуру и обладают специфическими иммуногенными свойствами; дают возможность получать специфические антисыворотки; открывают перспективу создания антистрептококковой вакцины.

Способ получения лизирующих ферментов путем культивирования микроорганизмов рода

Actinomyces на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и последующего выделения ферментов, отличающийся тем, что, с целью получения ферментов, лизирующих стрептококк группы А без разрушения стрептококковых анти6 генов, из микроорганизмов рода Actinomyces используют:

Actinomyces levoris 692

Actinomyces levoris 67

5 Actinomyces levoris 64

Actinomyces levoris 95

Actinomyces levoris 109

Actinomyces griseolus 88

Actinomyces alboflavus 194

Actinomyces griseochromogenes 275

Actinomyces odorifer 406

Actinomyces streptomycini 83

Actinomyces citreus 187

Actinomyces albus 454

15 Actinomyces species 492

Лс11поп1у сез species 161

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР №528340, 20 кл. С 13К 1/00, 1975.