Патент 605827

Способ получения ингибитора протеаз

 

ОЛ ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Своз Советских

Социалистических

Ресяублии

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (61) Дополнительное к авт. свид-ву—

2 (51) М, Кл.

С 12 О 13/10 (22) Заявлено 30.09.76 (21) 2408874/28-13 с присоединением заявки №вЂ”

Государственный квинтет

Соввта Мнннстроа СССР ва делам мзееретеннй и вткрытнй (23) Прноритет— (53) УДК

615.779.94 (088.8) (43) Опубликовано 05.05.78. Бюллетень № 17 (45) Дата опубликования описанкя;05.0478 (72) Авторы изобретения

И. С. Егоров, М. А, Аль — Нури, Н. С. Ландау и Л. И. Буяк

Московский ордена Ленни» и ордена Трудового Красного Знамени

Государственный университет we. М. В. Ломоносова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ

Изобретение относится к ферметпиой нромьпп,ленности, точнее касается способа получения ингибитора протеаз и может быль использовано в меди цине, гематологии, препаративной и аналитической биохиьяти, микробиологии и т. д. б

Известен способ получения иигибитора протеаз, эаклювющийся в том, что ВасНЬв cereus И 2 (FERM — Рй679) или Bacilius cereus УМА 1229 (FERM — PN682) культивируют в питательной среде, которая может содержать в качестве источников 1п азота пелтон,бульон, казвин, кукурузный экстракт, экстракт соевых бобов, а в качестве источников углерода — сахарозу, глюкозу, крахмал, декстрин, сусло. Процесс проводят цри 28-38 .С и рН6-7,5

М. 15

Указанный способ является: очень сложным и дорогостоящим, так как и состав сред в качестве источников азота входят только белковые формы азота или природные соединения. Кроме того, ингибнтор, полученный этим способом, не обладает по- 20 давляющим действием на способность пратеаз к растворению фибрина и тромбов крови.

Известен также способ получения ингибиторов протеаз, заключающийся в том, что ппамм Streptoчтусев vioiaceus NRRn 3859 культивируют в аэроб- 26

2 ных условиях глубинным способом на средах, которые могут содержать в качестве источников углерода глюкозу, фруктозу, арабинозу, рафинозу, крахмал или целлюлозу, глицерин или ннозит, а в ка мстве источников азота лептон или белковый порошок. Ингибиторы накапливаются в среде на 3 — 4 сутки роста при якжих температурах (15 — 20 С) и при поддержании рН около 5,0 f2)

Этот способ также является сложным и дорогим, так как предусматривает выращивание иродупента на многокомионеитных средах, в которых в качестве источнтвса азота нспользувл только белковые формы азота.

Кроме того,. фи этом способе наблюдветса невысокая скорость роста продуцента, а ингнбитор не обладает подавляющим действием на фибринолитическую и тромболитическую активность протеаз

Известен также способ получения ингибито ров протеаз, предусматривавиинй совместное выращивание культуры — продуцента протеазы и микроорганизма неактивного в отношении продуцирования протеаэ на питательной среде с последующим отделением клеток от кулатуральной жидкости и вьщелением из нее целевого продукта f3).

605827

Этот способ не обеспечивает высокого выхо- Спосс иллюстрируется следукицим примером. да ингибитора, подавляющего казеинолитическую, В известную синтетическую среду (глюкоза— фибринолитическую и тромболитическую активность 0,36%, сахароза — 0,72%, KNOs — 0,2%, MgSO4— микробных протеаэ. 0,123%, Кз Н1«04 — 1,37%) после стерилизации вноцелью предлагаемого изобретения является б сят 5% по объему двухсуточного жидкого посевно. ускорение и упрощение способа получения ингиби- го материала Aspargiltus агугае штамм 168, выратора, обладанацего подавляющим действием на их щенного на жидком 4 бал. сусле, и 5% по объему каэеинолитическую, фибрннолитическую и тромбо- жидкого двухсуточного посевного материала Fusariлитическую активность микробных протеаз, а также um, oxysporum КМ выращенного на жидком 4 бал. сусле. увеличение выхода ингибитора. r0 Совместное культивирование осуществляется глубинЭта цель достигается тем, что, в способе полу- ным способом в колбах емкостью 750 мл со 100 мл чения ингибитора протеаз путем совместного выра- среды на качалках (200 об/мин) цри 28 — 30 С в щивания культуры — продуцент» протеаэ и микро- течение 48 — 72 часов. По ходу развития определяют организма неактивного в отношении продуцирова- рН, биомассу, каэеинолитическую, фнбринолитичес. ния протеаз на питательной среде с последующим 15 кую и тромболитическую активности. Фибринолитнотделением клеток от культуральной жидкости н ческая активность культуральной жидкости продувыделеиием иэ нее целевого продукта, в качестве цента достигает 860 yc} ед/мл; каэеинолитическая культуры — продуцента протеаз используют Аэрег- 186 каз. ед/мл.и, тромб растворяется эа 55 мин.

9ПЬз oryzae штамм 168, а в качестве микроорга He .стивный организм образует следовые количестнизма неактивного в отношении продуцирования 20 ва протеаз, действующих на казвин (0,3.каз ед/мя) протеаэ — штамм Fusarium охуарогцт KM. и неактивен в отношении фибринолиза и тромболиСпособ заключаетс» в совместном выращива.. зиса. В культуральной жидкости смепинной культуры нии двух штаммов микроорганизмов, один из ко- тромболизис не обнаружен, казеинолитическая акторых, АзрегцПЫэ oryzae штамм 168, активно про тивность равна нулю, а фибринолитическая активдуцирует протеазы с каэеинолитическим, фибрино- g5 ность проявляется лишь в следовых количествах. лнтическим и тромболитическим действием, а дру-: гой, ппамм Fusarium охузрогап, КМ не образует протеаэ фибринолитического и тромболитического Формула изобретения действия, а образует нх ингибитор.

80 . Способ получения ингибитора протеаз путем

При этом получают посевной .материал каждо- совместного выращивания культуры — продуцеита го из штаммов, вносят этот посевной материал в протеазы и микроорганизма неактивного в отноше; равных количествах в нэвестную сийтетическую сре" нии продуцирования протеаз на питательной среде ду, содержащую глюкозу, сахароэу, азотнокислый с последующим отделением клеток or культураль. калий, сернокислый магний и двузамещенный фос 35 ной жидкости,и выделением из нее целевого профорнокислый калий. Культивирование смеси микро ;дуктв, отличающийся тем, что, с целью оргищэмов производят глубинным способом при . получения ингибитора, подавляющегo казеинолити исходном рН среды 6,5 — 7,0 в течение 48"-72 .часов ческую, фибринолнтическую и,тромболитическую при 28 — 30 С. Целевой продукт получают экстрак- активность микробных протеаэ, а также увеличецией, например органическими растворителями (эта- 40 иия выхода зщгибитора, в качестве культуры — пронол, метанол) илн активированным углем, из купь- дуцещг Протеаз.используют Aspergiltus qrygae штамм туральной жидкости сьюшаинай культуры микроор- 168, à и качестве микроорганизма неактивйого в ганиэмов после нредварнтельного отделения клеток отнош" иии продуцирования протеаэ — ппамм Fu.

Упрощение способа достигается тем, что выращива: sarium oxysporum KM, ние смеси грибов производят иа синтетической сре- 45 Источники информации, принятые во внима- де, состоящей всего иэ пяти компонентов (в иэвест- ние при экспертизе. ном (31 способе — сложные среды. содержащие бел- 1. Harem Японии № 49 — 39835, кл. 36(2) со, ковые формы азота и естественные продукты), а. 1974. ускорение способа достигается тем, что предлагае-. 2. Патент Англии№1343276,кл. С 3 Н,1974. мый способ осуществляют за 48 — 72 часа (а извест- 50 3. Авторское свидетельство № 436086, ный (3) способ за 72 — 96 часов). кл. С 12 О 13/10, 1972.

Составитель Н. Селиверстова

Техред М.Борисова Корректор А.власенко

Редактор О. Иванова

Заказ 2339/17 Тираж 568 Поднисное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открывший

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4