606554 - Способ получения -галактозидазы

Способ получения -галактозидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОП ИСАНИЕ „„„„„

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПА1ЕНУУ (61) Дополнительный к патенту (22) ЗаЯвлено 3012.75 (21) 2304401/28-13 (51) М. Кл, С 12 D 13/10 (23) Приоритет вЂ” (32) 03.01. 75

Гесуаауствев«ай кекктткт

Саввта М««««трав ССР ко делан «зкбретюк«)1

« «ткритк« (31) 538468 (33} OdA (43) ОпУбликовано 050578. Бтоллетень №17 (53) УДК 576,.8 (088. 8) (45) Дата опубликования описания 200478

Иностранцы

Сигееси Нарита, Хиросуке Наганиси, Акиеси Йокуци, Ициро Кагая (Япония) (72} Авторы изобретения

Иностранная фирма Хоккайдо Шугар Ко ЛТД (Япония) (71} Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ с -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

Изобретение относится к производству ферментов, в частности к технике получения о(. -галактозидаэы, используемой в качестве энэима для гидролиза рафиноэы в сахарозу и галактоэу, и может быть использовано в свекловично-сахарной промышленности.

Известен способ получения а--галактозидазы путем культивирования микроорганизмов рода Absidia на питательной среде (1) .

Однако известный способ не обеспечивает достаточно высокого выхода: фермента. В ферментах, получаемых при культивировании микроорганизмов рода

А1)е1д а, присутствуют наряду с

cL -галактоэидаэой также и инвертаэа.

Когда свекловичный сок или свекловичная масса (меласса) обрабатываются при использовании таких знзимов, то рафи- щ ноэа, содержащаяся в мелассе, разлагается под действием сс -галактозидаэы, тем самым снижается препятствие для кристаллизации сахарозы в ходе процесса производства сахара, которое создает рафиноза, и увеличивается выход сахарозы. Однако присутствующая в сочетании с б -галактоэидаэой инвертаэа вызывает нежелательное раз"ложение сахарозы. 30

В случае обработки большого объема мелассы количество разлагающейся под действием инвертаэы сахарозы увеличивается пропорционально, что приводит к снижению ее выхода.

Целью изобретения является повышение выхода фермента, имеющего высокую активность а- -галактоэидазы и не обладающего активностью инвертазы, Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе получения о -галактозидазы путем культивирования микроорганизмов иэ рода АЬь1а1а на питательной среде, иэ микроорганизмов рода АЬь1д1а используют штамм А1)ьМ1а griseoKa Maganish et ет..

Hir ahura ATCC 20430 или АЬ Й(а gr iseo(!ot

))ауап ъМ в4 Н1га пага var goetiii ATCC

20%31.

Оба штамма крайятся в Американской коллекции культур под номерами ATCC с 28 августа.1974 r.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов содержит источники углерода, например, крахмал, глюкозу, глицерин, мальтозу, декстрин, сахарозу и Инвертированную мелассу.

Источниками азота служат, например, соевая мука, ореховая пудра, измельченные семена хлопка, кукурузная жид-

606554 гидроокиси натрия, после чего вводят

О, 3% карбоната кальци я.

Данную среду разделяют на 5 частей по 200 мл кажцая и стерилиэуют. На стерилизованные порции срецы инокули5 руют суспенэии спор штаммов А Ь e d a

g Г 1 ь е О Еа (АТСС 20430) и АЬЪ1с11а

g r (ье о Га vat g ne Й«(ATCC 20431) в количествах, каждое из которых дает

2х10 спор.

1р Затем микроорганизмы подвергают культивированию при встряхивании или аэробному культивированию при темпео ратуре около 30 С в течение от 40 до

70 час при регулировании рН в преде(5 лах 5-8.

В конце культивирования мицелий испытывают на активность А -галактозидазы и на инвертазную активность.

В качестве контрольной расы используют штамм А Ь с) 1a 5874.

Результаты исследований приведейы в табл.1.

Т а

АЬЫйа g ì åo0à

АТСС 20430

А ЬьМ cr g iieola

var igne8ii

ARTCC 20431

Absurd a

l 453õ10 О

1,30 188900

31100 1, 816х10 О

1,29

5874 (контроль) 4

493х10 104

8,121

1,28 63100

Активность с -галактозидаэы определяют добавление 1 мл суспенэии ми цевкя к смеси 0,5 мл 0,06М мелибиозы и 0,5 мл 0,1М фосфатного буферного раствора с рН 5,2 и выдерживают 2 часа 50 при 40 С, после чего реакционную смесь нагревают на кипящей водяной бане

5 мин для инактивирования энзима и добавляют 1 мл 1,8Ъ-ногоВа(@я) 8НдО и

1 мп 2Ъ-ного семигидрата сульфата цин- 55 ка для удаления протеина. Полученную смесь центрифугируют„ а поверхностный слой, свободный от протеинов, анализируют на содержание глюкозы глюкостатным методом.

Учитывая, что количество глюкозы, освобожденной от мелибиозы, и концентрация энэима находятся в пропорциональной взаимосвязи, соответствующей цо 1000 микрограмм глюкозы, суспензию заранее разбавляют так, что она пс65 кость, мясной экстракт, пептон, дрожжевой экстракт, нитраты и соли аммония. Используемые неорганические соли включают, например, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфат магния, сульфат марганца, сульфат железа, фосфаты и карбонат кальция. При необходимости в среду вводят витамины.

В качестве индукторов для эффективного продуцирования e(. -галактозидазы в миделии используются такие вещества как лактоза, рафиноза, мелибиоза и галактоза.

Способ осуществляют следующим образом.

Питательную среду готовят следующего состава (%): лактоэа вЂ” 1,5, глюкоза вЂ” 0,5, сульфат аммония - О,б, кукурузная вытяжка - 1,0, КН РО вЂ” 0,4, МЯ 50 7Н О - 0,2, хлористый йатрий

0,2, рН доводят до 5,5 добавлением падает в пределы измерения, удовлетворяющие этой взаимосвязи. Количество свободной глюкозы умножают на число разбавлений. Активность Д, -галактозидазы, которая освобождает 1 микрограмм глюкозы, принимается за единицу.

Активность инвертазы определяют добавлением 1 мл суспензии мицелия к смеси 0,5 мл 0,06М сахарозы и 0,5 мл

0,1М фосфатного буферного раствора при рН 6,0 при тех же условиях реакции, как и для о1. -галактозидазы. Далее реакцнонный раствор центрифугируют, удаляют протеины, а поверхностный слой анализируют на содержание инвертного сахара по методу Сомогии-Нельсона. Активность инвертазы, которая дает 1 микрограмм инвертного сахара, принимают за единицу.

Вес сухого мицелия определяют сушкой при 105 С того количества его, 606554

Таблица 2

Время культивирования, час

1у 37

6,2

257000

6,4

6 5

5,9

5,7

5,4

1,99х10

1,29

0,08

5,8 которое выращивают в 100 мл культуральной среды с последующим взвешиванием.

Данные табл.1 показывают, что активность -галактозидазы, полученной по предлагаемому способу, выше, 8 чем при использовании известйого способа (контроль), при этом полностью отсутствует активность инвертазы.

При культивировании штаюеов по пред лагаемому способу к среде добавляют )() органическую кислоту, например гликолевую, лимонную, молочную, яблочную, фумаровую, виннокаменную, янтарную, глутаровую, малоновую, малеиновую, пировиноградную или галактуроновую, в качестве вещества для промотирования роста с(. -галактоэидазы, в количестве, составляющем 0,2-1,0Ъ в расчете на среду.

Получаемый мицелий хранят в форме таблеток, которые упаковывают или добавляют в реакционные емкости и сосуды.

Мелассу пропускают через реакционную емкость при рН 4-6 и 30-60 С.

Во время контактирования мелассы с мицелием рафиноза, присутствующая в мелассе, гидролизуется в сахарову и галактозу. Благодаря тому, что в эн- 30 зимах не содержитоя инвертаза, энзиматический гидролиз происходит только на рафиноэе и не протекает на саха-. розе.

Пример 1. Среду следующего сосу тава, (Ъ): лактоза - 0,5, глюкоза 0,7, сульфат аммония - 0,1, КЙ РО вЂ” 0,4, Мф50 7Н О вЂ” 0,2,(ИН ) СО вЂ” 0,06, хлористйй натрий вЂ” 0,2, кукурузная жидкость вЂ” 1,2 доводят до рН 5,5 гидра- 40 том окиси аммония.

В ферментер емкостью 20 л помещают

15 л среды и 800 частей на 1 млн.ко-, .колина, добавленного в качестве пеногасящего агента, и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см. Среду затем охлаждают и в нее инокулируют сус пензию спор, полученную культивированием Абs141a g г1 ее о Еa о g ne п11 (ATCC 20431) в картофельно-глЮкозиой агаровой среде при 27,5 С в течение

10 дней, в количес гве, дающем

1х10 спор/куб. см среды. Культивирова5 ние осуществляют при 30 С 18 час при аэрации со скоростью 1/4 объем/объем/

/мин и при перемешивании со скоростью

250 об/мин.

Полученный мицелий используют в качестве посевного материала.

Среду следующего состава (В): лактоза вЂ” 1,5, сульфат аммония - 0,6, кукурузная жидкость - 1,0, KH РО -0,4, семигидрат сульфата магния вЂ” 0,2, хлористый натряй - 0,2, доводят до рН 5,5 ,и 15 л среды помещают в ферментер объемом 20.л и с 1280 частей на 1 млн. коколина, добавлЕнного в качестве пеногасящего агента, и,стерилизуют

30:мин под давленйем 1,2 кг/кв.см.

На данной среде инокулируют 500 мл указанного посевного материала и культивируют при 30вС цри аэрации со скоростью 1/4 объем/объем/мин и при перемешиваиии со скорс, тью 350 об/дайн.

Культивирование прекращают при достижении содержания сахара в среде 0,1Ъ (по количеству глюкозы по методу Сомогии),, культивирование в течение

44 час.

Отношение между временем культивирования и количеством сА- галактозидазы приведено в табл.2 ° Анализ культурального бульона обнаруживает полное отсутствие инвертазы.

606554 ыежду временем 1" „ льтивирования и коли чеством образовавщейся 4. -галактозидазы приведена в табл,3, Пример 2. Absurdû gt заа3о

ATCC 20430 культивируют в среде и ус- ловиях, как в примере 1. Зависимость анализ культ ального у ур льного бульона показывает полное отсутствие инвертаэы.

Таблица 3 ухой миели и

r/10 0 алакфич. н на осе

1,38

25800

76500

112000

194600

4, 1 49 jz10

0,09

1,,0

Пример 3. K каждой из двена.-{цати порций основной среды состава (В) глюкоза - 0,5, сульфат аммония - 0,6 36 кукурузная жидкость вЂ” 1,0,I{M>PQ<-0,4, @$504 7Н О - 0 2, хлористый натрий

0,2, СОСО - 0,3, добавляют са ар иэ двенадцатй различных сахаров табл.4 в количестве, соответствующем 1,5В. 40

Среду готовят вначале растворением компонентов в указанном составе, ис-. .ключая Са,СО», доведением смеси до .рН 5,5 и последующим введением карбо ната кальция. 45

Порции среды по 200 мл каждая по

:объЕму распределяют в колбы Са.<а . ч1 таточный Сух хар в ви- миц г/1 г/ 100мЛ

204 30

20431

0.09

0,05

Ксилоза

1,16

1,28

1,13

20431

О,О6

0,05

0,03

0,02

11рабиноза

1,19

Глюкоза

1,21

1,38

20431

6,2

5,5

6,3

6,6

6,5

6,0

5,7

5,6

6,0 об семом 1 л и cTGpH JIB 3 T 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см. Затем инокулируют суспензии спор Ab51d10 f iseo(Q

ОТСС 204 и АЪsi8 o g isea0a J0l I < g и e h «ARTCC 20431 в количествах, дающих 1х10 спор/куб.см среды- 1{ультивируют при 30ОС 60 час на возвратно-поступательном вибраторе при амплитуде 7 см со скоростью

136 об/мин.

Результаты приведены в табл.4. Анализ показывает полное отсутствие инвертазы во всех ы целиях, на которых нсвольэуютая 12 раэлнчных сахаров.

Т а б л и ц а 4

606554

Сахари

Ос тат оч ный ахар в вне глюкозы, г/100 мл

1,21

20431

20430

0,02

0,03

0,05

Фруктоза

1,23

1,22

Ианноза

43lxl0

353х10

1,32

1,22

46200

Галактоза

1,31

20431

204 30

1,18

Иальтоза

234400

1,24

1,29

Лактоза

1 28

20431

20430

58600

1,29

1,30

0,81

0,82

1. 14.

Иелибиоза

20431

Рафиноза

48200

Растворимый крахмал

20431

1,37

0;06

1,08

1,37

О 09

20431

Декстрин

0,06

0 i04

0,05

0,04

0,05

0,04

0,07

0,09

0,03

0i03

0,02

0,08

Из табл.4 видно, что индуцирующие вещества, которые ранее использовали 40 для получения с(-галактозидазы при культивировании известных штаммов, эффективны и в культуре микроорганизмов по предлагаемому изобретению, а эффект лактозы является наиболее высоким

Пример 4. Основную среду состава (Ъ): лактоза вЂ” 1,5, глюкоза - 0,5, сульфат аммония вЂ” 0,6, кукурузная жидкость - 1,0,КН Р04-0,4, семигидрат маг-M ния вЂ” 0,2, хлористый натрий - 0,2, смешивают с 0,6Ъ лимонной кислоты, взятой в качестве вещества, промотирующего образование А -галактозидазы, затем рН доводят до 5,0 гидратом окиси аммония и к смеси добавляют 0,2Ъ карбоната кальция. Порции cpem no

200 мл каждая распределяют в колбы

Продолжение таблицы 4

1.467х10

1,831х10

243х10

2?0x10

724xl0

594х10 Сакагучи объемом 1 л и стерилизуют

30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см.

На среде инокулируют суспензии спор

А bs)dna f vise o(.a (ATCC 20430) и

AЪ siд1 а g г1sеo(. а vаг (9 пе h и (ATCC 20431) в количествах, дающих

1х10 спор/куб.см среды, и далее культивируют при 30 С в течение 60 час на возвратно-поступательном вибраторе с. амплитудой 7 см при 136 об/мин.

Для сравнения штаммы культивируют в. среде, идентичной по составу вышеуказанной среде, но без добавки лимонной кислоты. Контрольное культивирование проводят в тех же условиях, бульоны анализируют на активность d, -.

-галактозидазы.

Данные исследований приведены в табл.5.

606554 не добав- 1,280 177200 1,384х10 ляется,4ьэ1а р jseo5a

l,260 385400 3,059х10 ф .

1 290 230900 1 790 10

Abeidia p iieП р и и е р 5.. К . каждой иэ ll пор-;р ций основной ереды примера 4 добавлжот

Одну иэ 11 различных Органических кис лот, укаэанных в табл. 6 и 7, в коли504000

380500

Гликолевая

Молочная .

ЯблочнаяО

Фумаровая

Винная ,Янтарная

Глутаровая

Малоновая

310400

1,370

1,273

314100

240500

Малеиновая

Пировиноградная

1,194

1,325 307665

1,350 371200

0,06

Галактуроновая

Контроль (без добавки органической кислоты) 2,749х10 О ф

0,07

1, 290 30900 1, 790х10 О

0,03 (ATCC 20430)i добавляется

О 08

Осо7

0,04

0,06

0,08

0,04

0,06

0,07

0,02

1 196

1,276

1у175

1,208

1,394

1,300 и штаме Яй

ofa

У рув тех же .Условиях как примере 4.

Данные исслед ний активности с -галактоэидазы приверни в табл.5. и 6 соответственно для штающов ОТСС 431 и ЬТСС 430, Т а б л и

4,214х10 ф

3, 730х10

3,487х10

3 150х10 ф

2,619х10

2,388х10

2,293х10

2,266х10

2,014х10

2,322х10

606554

Та бли ца 7

293100

Гликолевая 0,05

Молочная 0,03

Яблочная 0,03

Фумаровая 0,07

1,202

1,204

0,06

215900

Винная

Янтарная 0,04

Глутаровая 0,04

Малоновая 0,08

Малеиновая 0,07

197100

Пировиноградная

1,795х10

2,237х10

1,260 226200

1,223 273600

0,05

Галактуроновая

0,06

Контроль (без добавки органической кислоты) 4

1,280 177200 1,384х10 0

0,02

Таблица 8

0,2

1,255

1,260

1,270

1,273

0,02

Лимонная

0,4

0,05

0,06

0,08

0,09

0,6

0,8

1,0

1,190

1,203

1,246

1,237

1,294

1,228

1,260

Данные табл ° 6 и 7 показывают, что все органические кислоты обладают эффективностью в промотировании роста с(. -галактозидазы так же, как лимонная кислота.

Пример б. К порции основной среды примера 4 добавляют независимо лимонную, молочную и гликолевую кис4

2 989х10

2г851Х10

2,768xl0

2,436х10

2,145х10

1,84lxl0

1,758xl0

1,758хl0

1,564х10

35 лоты в раэличнык количествах, соответствуницих 0,2, 0,4, 0,6 0,8, И 1,0В.

При тех же условиях АЬь Ьа g г (зсо1а var ig eWii (ATCC 20431) и Absjdia

g 1ъбе Ва (ATCC 20430) подвергают культивированию.

Результаты исследований соответственно приведены в табл. 8 и 9.

346100 2,758xlO

401200 3,184х10

496 200 3, 938xl 0

478700 3, 769xlO

462900 3,63бх10

606554

Продолжение табл. 8

2,490х10 О 0

3,105xlO О О

3, 730х10 О О

4 ф

3,680х10 О О ,ф

3,517х10 0 О

2,695хlО О ф

3,404хlО О О

4,214xlO О О

4,100х10 О 0

3,914х10 О 0

0,4

0,6

448400

1, 258

1, 276

1,277

1,275

0Ä06

0 07

0,08

0,09

0,8

1,0

465800

1,189

1,195

1,196

1,190

1,Л0

Гликолеиая

0,02

0 05

0,08

0,09

0 09

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Контроль (без добавки органической кислоты) 1,290 230900 1,790х10 0

0,03

2,145х10

2,456xlO

3,059xlO ф

3, 008х10

2, 768xl0

1, 244

1,260

1,265

0,4

0,6

0,8

О,ОЗ

0,04

0,05

О, О 8

380500

1,0

1,265

350200

О.

Молочная

0,2

0,02

0,03

0,04

1,203

1,204

1,205

1,208

325100

2,174х10

2,455х10 ф

2,851х10

2,698х10

2,488х10

-ф

0,4

0,6

0,8

300600

0,2

0,4

0,6

0,8

liO

0,02

Гликолеиая

1,200

325700

2,253х10

2,815х10

2,989х10

2,896х10

2,696х10

0,03

1,202

1,207

1,208

0,05

0,06

Контроль (без добавления органической кислоты) 4

1,280 177200 1, 384х10 О

0,02

606554

82,1

82,0

81,0

78,,0

77,2

77 0

76,8

3.24

3,21

3,17

3,. 05

3,04

3,02

3,01

Из данных таблиц 8 и 9 видно, что количество любой из органических кислот, добавленных для промотирования продуцирования A. -галактозидазы, находится в пределах от 0,2 до 1„03 и что количество d. -галактозидазы постепенно уменьшается по мере увеличения органической кислоты эа пределами 1,0Ъ.

Пример 7. Свекловичную мелассу разбавляют водой до 30 (по Бриксу) о и рН доводят до 5,2 добавлением серной кислоты. 200 г полученного раствора, содержащего 5,8 г рафиноэы, мицелия микроорганизма по данному изобретению, имеющего сухой вес 0,971 г и 17540000 единиц + -галактозидазы, согласно примеру 1, подвергают реак- ции при 50оC в течение 2 час 30 мин при встряхивании.

Затем мицелий отделяют фильтрованием и промывают водой, фильтрат и .промывные воды объединяют и определенный объем данной смеси анализируют с помощью бумажной хроматографии на остаточное содержание рафиноэы и на увеДанные табл.10 показывают, что активность о(. -галактозидазы, содержащейся в мицелии плесени, по предлагаемо" му изобретению снижается только на

16В даже после ее семиразового использования для обработки свекловичной мелассы, и с -галактозидазу после такой обработки можно использовать для разложения рафинозы.

Пример 9; Свекловичную мелассу разбавляют до 50 (по Бриксу) и рН доводят до 5,2 добавлением серной кислоты. 200 г данного раствора, содержащего 9,8 г рафиноэы, мицелий плесени(имеющий сухой нес 1,619 г и активность с - -галактозидаэы 29400000 единиц), полученный в примере 1, дают возможность реагировать при 50 С в о течение 2 час 30 мин. В конце реакции раствор анализируют на степень разложения рафиноэы и на увеличение содержания сахароэы. личенное содержание сахарозы. Более точно образец проявляется в растворителе, состоящем иэ 6 частей н-бутанола, 4 частей пиридина и 3 частей воды. Зоны рафинозы и сахароэы отде5 ляют, промывают водой и анализируют с помощью цистеин-карбаэольного процесса.

Установлено, что 81% первоначального содержания рафинозы разлагается, 10 а содержание сахарозы увеличивается на 3,19 г.

Пример 8. 200 г свекловичной мелассы 30 (по Бриксу), приготовлено ной как в примере 7, с мицелием, имею15 щим активность о(- -галактозидазы

17640000; единиц, дают возможность реагировать так же, как в примере 7.

После реакции мицелий промывают водой, добавляют к новой порции разбавленной мелассы и выдерживают для реакции.

Таким образом мицелий используют. понторно семь раз, полученные растворы анализируют на остаточное содержание рафиноэы и на увеличение содержания сахароэы.

Данные исследонаний приведены в табл.10.

Т а б л и ц а 10

При этом устанавливают, что разлагается 60,4Ъ рафиноэы,.а прирост сахарозы составляет 3,99 г.

Предлагаемый способ получения о(.

-галактозидазы по сравнению с известным решением той же задачи обеспечивает повышение ныхода фермента, имеющего высокую активность, при использовании новых микроорганизмов иэ рода

At1s dia, а именно А bsidi g vi eola ATCC 20430 и Ahsid a g г1seо(, а чаг

Формула изобретения

Способ получения о(. -галактозидаэы путем культивирования микроорганиэмон рода А Й s i d ia на питательной среде, отличающий с ятем,что,с целью повышения выхода фермента, из микроорганизмов рода Absi 4 а ис606554

Составитель .А.Áðàæíèêoâà.

Редакто О.Иванова Техред ЗФанта., Ко екто M.демчик

Заказ 2198/2 Тираж 568 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

1 3035 Москва Ж-35 Ра ская нлб. . 4 5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 пользуют штамм АЬ| й1а yriseoi,a Nagqhiehi et kiraSarй ATCC 20430илиАЬь и сз рчьео3о Надап1ей1 е1 kiraSar a vai igne hei

ATCC 20431.

Источники информации,.принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент ClUA 93832284 кл.195-11

1974.

Способ получения -галактозидазы

Патент 606554