Патент 610864

Стимулятор репродукции парагриппозных вирусов

 

СЕООМ)ЭНА, О и И С Л й-И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советсквтх

Соцтвалвтстическттх

Респттблнтв

610864

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6!) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 03.0876 (2!) 239190 6/28-13 (5!) с присоединением заявки,пв (23) Приоритет (43) Опубликовано150678. Бюллетень Jтв 22 (53) М. Кл.

С 12 К 7/00

ГФФтЩФТФФФФЯФ ФФЯФтвт

ФФФФта ИФФФвтрвв OCCAM

ФФ рФФв -ФФФ4увтФФФ3

Ф Фтввмтвй ll< a 576. 8. 097. 4 (088.8) (45) Дата опубликования описания200578

О.В.Давыдов и Т.В.Карпова

P2) вторы изобретения (7!) Заявитель

Белорусский ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (54) СТЩ61УЛЯТОР РЕПРОДУКЦИИ ПАРАГРИППОЗНЫХ

ВИРУСОВ

Изобретение относится к вирусологии, а именно к .веществам, способствующим накоплению вирусов в заражен ных клетках.

Известно использование липидных экстрактов в качестве ингибиторов вирусной активности (1) .

Целью изобретения является расширение арсенала средств, стимулирующих репродукцию вирусов.

Эта цель достигается применением липидных экстрактов в качестве стимулятора репродукции парагриппозных вирусов.

Пример 1. Применение липидного экстракта из печени крысы для сти- муляции репродукции парагриппозного вируса 1 типа.

K 5 г гомогената печени крысы добавляют 5 мл дистиллированной воды, 2 мп 96%-ного этилового спирта, доводят рН образца до 12 1н. раствором

KOH и помещают на 2 час íà кипящую водяную баню.

К полученному образцу добавляют

5 мп петролвйного эфира, встряхивают

5 мин и удаляют органическую фазу.

Процесс экстракции петролейным эфиром повторяют, удаляют органическую фазу и к оставшейся в пробирке водной фазе (гомогенат) добавляют 10 мл смеси 96%-ного этилового спирта и хлороформа, взятых в отношении 1:3.

Пробирку встряхивают 30 мин, цент« рифугируют, отделяют нижний слой (хло5 роформный экстракт) и испаряют в стерильных условиях. Сухой остаток липидов эмульгируют в 5 мл 5%-ного раствора гемогидролизата и приготавли в ют рабочее разведение эмульсии 1:5 на той же питательной среде.

В пробирки с культурой клеток первично - трипсинизированной почки эмбриона человека в опыте вносят по 0,1 мп вирусосодержащей жидкости парагриппа

)5

1 типа (штамм CC 1889) с исходным титром 3 ед.03 /0,1 мл, 0,1 мл рабочего разведения эмульсии лнпидов и 0,8 мл

5%-ного раствора гемогидролизата, В контроле вместо эмульсии используют

5%-ный гемогидролизат.

После 5-дневной инкубации при

0 и трехкратного замораживания и оттаивания проводят титрование инфекционности полученных образцов в объеме 0,1 мл на ткани первично-трипс .низированной почки эмбриона человека.

В образце вируса, репродуцированного с добавлением липидного экстракта, инфекционность составляет

610864

7,5 ц)) /0,1 мл, а в параллельном

"контроле 5,33 fg ОЭ, /0,1 мл, . Добавление в питательнум среду эмульсии липидов из ткани печени крысы повышает выход инфекционного п 1рагриппозного вируса 1 типа на 2,17 EgUg>. т.е. в 14ь раэ.

Пример 2, Применение липидного экстракта из печени крысы для стимулирования репродукции парагриппозного вируса 1 типа.

К 5 r гомогената печени крысы добавляют. 5 мл дистиллированной воды и 10 мл смеси 96Ъ-ного этилового спирта и хлороформа, взятых в отношении

1:3. Образец встряхивают 30 мин, центрифугируют, отделяют нижний слой . (хлороформный экстракт) и испаряют его до объема,1 мл. К полученному концен трированному экстракту липидов добавляют 1 0 мл холодного (+4 С) ацетона и

Ф 20 оставляют при этой температуре на

24 час, Выпавший белый осадок липидон отделяют центрифугированием при

1000 об/мин н течение 1 мин и растворяют в 5 мл хлороформа. Хлороформ ис- 25 паряют в стерильных услониях и эмульгй руют сухой остаток в 5 мл .5%-ного раствора гемогидролизата., В опытные пробирки с культурой клеток пернично- трипсинизированной 30 почки эмбриона человека вносят по

О,l мл вирусосодержащей жидкости ïàparpunna 1 типа (штамм СС=1889) с исходным титром 3kpUE/0,1мл,0,1мл эмуль" гированных липидов в разведении 1:5 на растворе 5%-ного гемогидролизата и 0,8 мл раствора 5Ъ-ного гемогидролиэата. В контроле липидный экстракт заменяют раствором 5%-ного гемогидролизата..

На пятый день инкубирования при 4"

37 С пробирки подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и титруют инфекционность полученных образцов н объеме 0,1 мл на.ткани первично-трипсинизированной почки эмбриона 45 человека.

В образцах с добавлением эмульсии липидон инфекционный титр вируса составляет 6,77(:(ОЗ /0,1 мл, а в кбнтроле 5,33 1 ПЭ /0,1 мл. 50

Добавление. в культуральную жидкость экстракта липидов из печени крысы повыаает выход инфекционного вируса парагриппа 1 типа на 1,448 ОВ т.е. н 28 раз. 55

I1 р и м е р 3. Применение липидного экстракта из почки крысы для стимулирования репродукции парагриппозного вируса 3 типа.

К 5 г гомогената почки KpbIcbI Добавляют 3 мл дистиллированной воды,,2 мл

96%-ного этилового спирта, 1 н. раствор КОН до рН 12 и помещают на кипящую водяную баню на 2 час. К полученному образцу добавляют 5 мл петролейного эфира, встряхивают 5 мин и удаляют органическую фазу. Экстракцию петролейным эфиром повторяют, органическую фазу удаляют, а к водной (гомогенату) приливают 10 мл смеси 96Ъ-ного этилового спирта и хлороформа (1:3) .

Пробирку встряхивают 30 мин, центрифугируют, отделяют нижний прозрачный слой (хлороформ) и испаряют его в стерильных условиях.

Сухой остаток эмульгируют в 5 мл раствора поддерживающего гемогидролизата.

В пробирки с культурой клеток первично-трипсинизированной почки эмбриона человека вносят по 0,1 мл парагриппозного вируса 3 типа (штамм ВОК) с исходным титром 0,5 fgUD /0,1 мл

0,1ìë эмульгированного липидного экстракта в разведении 1:10 и 0,8 мл раствора поддерживающего гемогидролйзата.

После 5-дневного инкубиронания при

37 С пробирки трижды заморажинают и оттаивают и титруют инфекционность пслученных образцов в объеме 0,1 мл на монослое первично-трипсинизированной почки эмбриона человека.

В образцах с добавлением эмульсии липидов инфекционный титр вируса равен 5, 33fg UDgp /О, 1 мл, в контроле

3,238/ 0Х),/О, 1 мл.

Добавление в культуральную жидкость экстракта липидов из 11очки крысы повьп11ает выход инфекционного вируса парагриппа 3 типа на 2,10 02,, т. з. н 126 раз.

Пример 4. Применение липидно го экстракта из подсолнечного масла для стимулирования репродукции парагриппозного вируса 1 типа.

К 1 r подсолнечного масла добавляют 2 мл 1н. раствора NpIOH,2 мл 96%-ного этилового спирта, помещают образец на кипящую водяную баню на 2 час.

Верхний слой образовавшейся двухфазной системы удаляют и к оставшейся водной фазе добавляют 5 мл петролейного эфира, встряхивают 5 мин и удаляют верхний слой образовавшейся двухфазной системы (органическая фаза) .

Экстракцию петролейным эфиром повторяют, удаляют органическую фазу, доводят рН водной фазы до 7 и добавляют 10 мл смеси 96%-ного этилового спирта и хлороформа, взятых в соотношении 1:3. Пробирку встряхивают 30мин, центрифугируют, отделяют нижний слой (хлороформный экстракт) и испаряют его н стерильных условиях, сухой остаток эмульгируют в 5 мл 5%-ного раствора гемогидролизата.

В пробирки с культурой клеток первично-трипсини зированной почки эмбриона человека вносят по 0,1 мл вируса парагриппа 1 типа (штамм CC 1889) с исходным титром 0,58gUD /0,1 мл, 0,1 мл эмульсии липидов и разведении

1: 5 на 5%-ном растворе гемогидролизата, 610864

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Техред М. Борисова Корректор Н.Ковалева, Редактор Е.Хорина

Заказ 3097/21 Тираж 568 Подписное

gHHHllH Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,. Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

0,8 мл 5%-ного раствора гемогидролиэата.

Через 5 дней инкубирования при

37 С образцы три раза эамораживают и оттаивают, титруют инфекционность н объеме 0,1 мл.

В образцах вируса, прошедшего инкубацию в присутствии эмульсии липидон подсолнечного масла, инфекционный титр ранен 51 03 /0,1 мл. В контроле (без добавленйя эмульсии) титр ви- 10 руса составляет 3,676gUD о /0,1 мп.

Культивирование вируса н присутствии липидон из подсолнечного масла повышает его титр в 21 раэ.

Пример 5. Применение липидного)5 экстракта из почки кролика для стимулирования репродукции парагриппоэного вируса 2 типа.

К 5 г гомогената почки кролика добавляют 5 мл воды и 20 мл смеси этило-. 0 ного спирта и хлороформа (1:3), встря, хивают 30 мин, центрифугируют, отделяют нижний слой (органическую фазу) и испаряют его в стерильных условиях.

Сухой образец эмульгируют в 5 мл -раствора поддерживающего гемогидролизата

25 . и вносят его в объеме 0,1 мл в пробирки ки с клетками первично-трипсинизи- рованной почки человека зараженны

24 ч

I ные час назад вирусом парагриппа 2 типа. Для заражения клеток в пробирки .вносят вирусосодержащую жидкость с исходным титром 1,33Eg О.о /0,1

0,8 мл поддерживающего гемогилролизата.

Пробирки инкубируют прн 37 С н тео чение 4 дней, извлекают, подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и титруют инфекционность полученных образцов в объеме 0,1 мл на ткани первично-трипсинизиронанной почки эмбриона человека., В образце с добавлением эмульсии липидов инфекционный титр вируса составляет 4,77 и н контроле 3,503 /0,1мл °

Добавление в культуральную жидкость экстракта липидов из почки кролика повышает выход инфекционного вируса парагриппа 2 типа в 19 раз.

Применение липидных экстрактов в качестве стимуляторов репродукции парагриппозных вирусов позволит увеличивать урожаи вирусон в 10-1000 раэ по сравнению с вариантами беэ стимуляторов.

Применение липидных экстрактов в качестве стимулятора репродукции парагриппозных вирусов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1.саэаЕе. Ехре 1тепФ1ac пед а1ъь.

99, 1954, р.429-449.