Способ получения иммобилизованных никотинамидадениндинуклеотид (над)-зависимых ферментов

Способ получения иммобилизованных никотинамидадениндинуклеотид (над)-зависимых ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ н>ехвовт

И3ОБРЕТЕ Н ЙЯ (61) Дополнительное к ввт, свил-ву (22) ЗадвлЕно 22.12.75(й) 2304911123-04 Ф1) 34 Кл

С 07 Ст 7/02 с присоединением заявки 34

Гасумдрстввииьй ивыатвт

Вовйтв Mwupoa СИР в диан кзФрютюннй я эткрытмм

I (43) Опубликовано 15.07.78áþëëeòeíü Ит 26 (53) УЙК 577,15. .о7 (овв.в) (46) Дата опубликования описания 20.06,78

П. П. Гладышев, М, И. Горяев и Ю. А. Шаповалов (72) АЬторы изобретения

Ордена Трудового Красного Знамени Институт химических наук AH Казахской ССР (7 1) Заявитель

1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИД (НАД) ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способам по- лучения им мобилизованных ферментов, которъ е имеют большие перспективы дпя использования их в химической промышленности ддя получения продуктов ферментативных реакций.

Известно большое число способов получения иммобилизиванных ферментов на твердых носителях органической и неорганической природы, адсорбированных о на пористом стекле, целдюлозе, ианообменной целлюлозе, а также на синтетических ионообменных смолах. Одним иэ недостатков известных методов иммобилизации фермеытов является ограниченный 15 спектр используемых ферментов. Это объясняется наличием значительного ко пичества ферментов, которые требуют для проявления ферментативной активиос ти участия низкомолекудярных кофермен- 26 тов. Поэтому для проявления такимн ферментами активности в иммобилизованном состоянии в гетерогенной системе должен присутствовать растворенный ко рмент., С другой стороны, проведение 2s

1 процессов в непрерывном режиме требует расхода большого количества кофермеы тов, которые очень дороги, и, в отличие оУ самого фремента, участвуют топько в одном цикле реакции (1).

Известен способ получения иммобипи" зованных никотииамидадениндинукпеотид (НАД)-зависимых ферментов, включающий связывание кофермента HAG в окисленной ипн восстановленной форме с носителем, связывание фермента с присоединенным к носителю коферментом

НАД. Способ осыован на ковалентном свяэьгвании кофермента и фермента с носителем при помощи реакции диазосочетаыия. Способ включает несколько стадий; получение аминопроизводного носителя, дыазотироваиие аминированного носителя, связывание кофермента с диаэопроизводным носителя и присоединение фермента к коферменту на носителе. Про цесс длится более суток(2).

Иелью настояшего изобретения являет» ся упрощение процесса получения иммобилизоваиных НАО-зависимых фермеытов

6 15087 с сохранением активности исходного фермента. .Поставленная цепь достигается тем, что цри получении иммобипизсванных HAP.зависимых ферментов. связывание НАД .с носытепем осуществляют путем сорбции, В качестве носителя используется целлюлоза и ев производные. В качестве НАД-зависим го фермента используют апкогольдегидрогениэу. И качестве производных целлюлозы исподьэукт гуанидоэтилцеллюлоэу.

Сущность изобретения заключается в сорбцин на носителе кофермента HALT, (a оки пенной ипи востановленной фор- : ме) с последующим присоедднением фермента к спою сорбированного кофермента, 1

Предпочтительно процесс проводят спедукхдим образом. Производят сорбцию кофермента f H4Ä или НАД Н )на сорбвнтах, обеспечивающйх прочное. связывание ко-. фермента с последующим связыванием

20 ферментов со слоем сорбированиого кОфермента эа счет специфического взаимо действия фермент-кофермент, а также взаимодействия фермента с носителем.

Для замены инактивированных в про25 цессе работы фермента и кофермента на новые предлагается осуществлять их десорбцию в условиях, отличных от условий в которых рабо ает система фермент

30 кофе р мент.

Описыг.аемый способ испытан всистеме алкогольдегидрогенаэа-никотииамидадвниннук пеотид (НАД). Для этого кофермент НАД сорбируют, например, на целлюлозе иэ

З5 водного 0,015 М буферного раствора фосфата калия при рН 7,7 и вводят в систему фермент - аихогопьдегидрогеназу. При этом происходит «самосборка« иммОбийизоваииой фермжФт кофермвитнОй 4 сйстемы — цеилюлоза-НАД-алкогольдегидрогеназа, которая в уеиовиях проведения ферментативного ропееса восстановления лактапьдегида s 1,2-пропандиоп (0,015 М буферный раствор фосфата калия при рН 7,7, температура 37 С,} прочно удерживается на сорбеите.

В случае потери активности ферменткоферментиой системы проводится ве де- 5п сорбция непосредственно в ферментатив- ном реакторе (например, проточной коПонхе) воднО-спиртовой смесью 3:.1 при рН-10 с последующей: иммобнпизацнвй активных K05441oHeHT lIo описывае- 55 мому способу.

П р н м е р 1. Из исходного раствора восстановленного никотинамидаденин»

АинУклеотидй f HAll + H V кпипаит оаз1иа6 фосфата калия рН 7,7 берут апиквоту, додвржащую примерно 260 ° 10 HAQ Н и б в 2 мп буферного раствора (коМ4ество взятого для србции HALT Н проверяют " спектрофотометрическнм методом при

340 ммк в 1: см кювете, учитывая, что коэффициент;" светопогашения: рпа НАЯ

МА НРАФ

° Н /Е .,6,2);Приготовленный раствор кофермейта приливают к 0,1 г гуанидоэтипцедпюпоэы. Сорбцию кофермента проводят.в течение 1 ч цри 5 С и нерио дическом перемешивании. После сорбции целлюлозу отделяют от раствора и последний спектрофотометрируют. По разности исходнйх и конечных количеств

НАД ° Н определяют величину сорбции.

Йця гуанидоэтипцвппюпоэы oíà corn ветствует 59,6%. Слабо связанный с сорбецтом HAft Н., отмывают буфер, ным раствором.

Количественное определение иммобипиэоваиного на гуанидоэтипцвппюпозв . HAll . Н осуществпяют по нингидрин-сер . нокиспотной методике. Ипя этого готовят раствор, содержащий следующие компоненты; О, 15 ммопь/мл буфера фосфата калия (рН 7,7)„50 мкмопь/мл этанопа, 17 мкмопь/мп пактапьдегнда н

О, 16 мг/мл апкогопьдегидрогеназы (всв компоненты реакционной смеси добавляют при 0 С).0,2:мп полученной смеси приливают в пробирки со. стандартными растворами, содержащими известное количество HAft Н и с 0,1 r ценпюпозы с сорбированным НАЦ Н . Реакционные смеси ннкубируют в термостате прн

37 С в течение 45 мин, После чего фер р мвнтативную реакцию в стандартных растворах прекращают добавлением 1 мп серной кислоты. В случае, иммобилнзованной системы реакция останавпивавтсй отделением раствора. субстрата от иммобипизованной ферме пкоферментной сне темы фильтрованием в центрифуге, Дпя стандартизации условий,,в фипьтрат добавляют 1 мп. серной кислоты. Растворы тщательно перемешивают и снова инкур бируют при 70 С в течение 10 мин.

Реакцнонцую сми=ь охлаждают до комнатной температуры и при тщательном перемешиванин добавляют 40 мкп свежеприготовленного раствора нингндрина (3% нкнгидрина и SL бнсупьфкта натрия). Раствор оставляют стоять при комнатной температуре в течение 60 мин„ затем в смесь приливают еще 1 мп концентрированной серной кислоты и оотавпяют стоять при комнатной темпераmac a течеиие Я сии Оптическим пл т615087

Формупа изобретении

Ф

1, Способ нолучения иммобилиэованных никотинамидадениндинуклеоттид (НЛ!1)зависимых ферментов, вкпючаюший связь:= ванне кофермента HAQ в окиспенной иии восстановпенной форме с носитепем и .послещГкхцее присоединение фермента к коферменту на носитепе, о т и и ч а юш и и с я тем, что с цепью упрощения ,процесса с сохранением активности ис:,ходного фермента, связывание НАД с носитепем осуществпяют путем сорбции а s качестве носителей используют цеплю оэу и ее производные, 2,Способпоп. 1, отпичаюш и и с s тем, что в качестве НАЛ зависимого фермента используют апкогоиьдегидрогеназу.

3. Способ по п. 1, о т и и ч а юш и и с я тем, что в качестве производных цецпюлозы испопьэуют гуанидоэтилцеппк позу.

Источники информации принятые во

5 внимание npII экспертизе;

"1. Иммобипизоианные ферменты Сов ременное состояние и перспективы. Том

° . ° - ° ° ,Под ред.. И. В. Березина, Q. К. Антонова, К, Мартинена. Изд. 1976. щ 2.М.К. йе ЬЮС,H.%I. Vleet aE. E, Н.Х.Brigkt, В3оспет. Ь ор Ьмь..Res. ComwuII> )9 f1 ФЗ, 347.

Активность сорбированного кофермента определяют по капибровочной кривой в . зависимости от вецичины оптической ппотиостя, Попучают копичественное эна чение активности сорбцрованиого НАД Н»„ проявпяккцего физиопогическую активность в иммобипизованном. состоянии. Оно окаэапось равным 56,3% от общего копичаства кофермента, сорбированного на матрицуе П р и-м е р 2. Колонку размером

0,3 х 10 см запопняют 0,5 г гуанидоэтипделпюпоэы, уравновешивают 0,015 М буферным раствором фосфата калия (рН 7,ф

Через копонку пропускают до насыщения .0,005 мопь/и раствор инкотинамидаде ниндянукпеотида(НАД H >) Осушествпяют спектрофотометрический контроль эпюата на выходе иэ колонки пРи,340 мм, Спабо связанный HAl3. Н отмывают буферным раствором.. Пропускают через колонку раствор фермента с концентрацией 2 10 мопь/и в 0,015. М буферном растворе фосфата калия, (pH 7,7) до насыщения сорбента, алюат на выходе спектрофотометри« руют при 280 ммк. Избыток фермента отмывщот,. эпюируя буферный раствор через к<;лонку.

Работу попученной фермен коферментной системы проверяют-спедующим образом. Через койонку с фермент-коферментной системой .эщоируют: со скоростью

2 мп/ч раствор, содержащий следующие компоненты. О, 15 ммопь/мп буфера фоофата капни с рН.7,6 50 мкмопь/мл этанопа и 17 мкмопь/мп пактапьдегида.

Смесь поспе прохождения через колонку фракционируют на коппекторе фракций.

Количество образующегося в результате ферментативной реакции 1,2-пропандиопа определяют по нингидрин-сернокиспотной методике.

Япя удапения инактивированной системы проводят десорбцию в динамических усаовиях смесью вода-спирт в соотношении 3:1 при рН 10. Эпюат на выходе цэ копонки спектрофотометрируют при

280 ммк, Сорбент промывают буферным аствором и заново проводят иммобилизацию кофермента и фермента Ilo описанной выше методике. При этом попучают активность, равную исходной.

Составитепь A. Богаров

Редактор Л. Новожипова Техред А. Алатырев Корректор Е. Папи

Заказ 3840/17 Тираж 559 Подписное

11НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по дпеам изобретений и открытий

113035. Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5