Способ получения метан-окисляющих бактерий

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских C©4иалмстмчвсинтт

Республик (!!) 615871 (61) Дополнительный к патенту(22) Заявлено 15.09.71(21) 1699988/28-13 (23) Приоритет - (32) 15,09.70 (31) Р 24045589.4 (33) ФРГ (43) Опубликовано 15.07.78.Бюллетень 4 26 (45) Дата опубликования описания06.09.78 (5!) М. Кл, С 12 К 3/00

Государственный номнтет

Савета Мнннстрав СССР

ll0 делам нзобретеннй н открытий (53) УДК663.11 (088.8) Иностранцы

Юрген Овербзк (ФРГ) и Монир Нагуиб (Египет) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Макс-Планк Гезельшафт цур Фердерунг дер Виссеншафтеы, е. Ф. (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТАН-ОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к вопросам микробиологического синтеза протеинов из метана, и касается способа получения метан-окисляюшцх бактерий, способных перевести метан в пищевой белок, Известен способ получения метан-окисляюших бактерий, согласно которому пробу почвы. вносят в жидкую минеральную !

О питательную среду, содержащую двухзамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и количестве 0>2 г/л и следы хлорного железа. Культивирование прово дят в присутствии смеси метана и воздуха, взятых в соотношении 1:1. Полученную культуру пересевают на минеральную агаровую среду с последующим культивированием и выделением бактериальной култ туры (Ц.

Однако полученную бактераальную культуру нельзя считать стабильной, метаиоспецифичной и высокоактивной, к тому же сам способ ее получения сложен.

Целью изобретения является упрощение процесса и получение бактериальной культуры, обладающей высокой активностью.

С этой целью согласно предлагаемому способу используют пробу почвы, выделенную из донного отложения пограничного биотопа, а в жидкую минеральную питательчую среду (на 1 л) дополнительно вносят 1 мл раствора, приготовленного пу тем смешивания 18 л дистиллированной воды со следующими компонентами, г: хлористый литий 0,5; пятиводный сульфат меди 1,0; семиводный сульфат цинка 1,0; борная кислота 11,0; сульфат аммония

1,0; гидрат хлористого олова 0,5; шестиводный сульфат никеля 1,0 четырехвод ный хлористый марганец 7,0; шестиводный нитрат кобальта 1,0; окись титана 1,0 йодистый калий 0,5 и бромистый калий

0э5, Предлагаемый способ заключается в следующем.

Образец донного осадка воцного (акватического) пограничного биотопа помещают

615871

Углеводы: глюкоза фрукт оза галактоэа

I манноза рибоза

s жидкую минеральную питательную среду и ведут процесс культивирования, насыщая среду смесью метана и воздуха, взя-. тых в отношении 1:1 (no объему).

Для используемого донного осадка пограничного биотопа характерным является

5 то, что в нем отсутствуют условия для процесса обмена веществ метан-окисляющего штамма бактерий в силу нехватки; кислорода в растворе минеральных пита10 тельных веществ.

Для приготовления жидкой минеральной питательной среды используют из расчета на 1 л двухзамещенный фосфорнокислый калий; сернокислый магний s количестве

0,2 г/л и следы хлорного железа, а также 1 мл раствора, содержащего на 18 л дистиллированной воды следующие компоненты, г: хлористый литий 0„5; пятивод ный сульфат меди 1,0, семиводный сульфат цинка 1,0; борная кислота 11,0;суль- " фат аммония 1,0; гидрат хлористого олова 0,5; шестиводный сульфат никеля 1,0 четырехводный хлористый марганец 7,0; шестиводный нитрат кобальта 1,0; окись титана 1,0, йодистый калий 0,5 и бромистый калий 0,5.

Полученную в результате культивиро вания культуру пересевают (переносят мазки) на пищевую среду-минерально-ага- ур ровую и ведут последующее культивирование на ней. Затем выделяют единичные клетки из образовавшихся колоний и их культивируют на питательном растворе, состоящем из минеральных веществ в при- з сутствии смеси метана и воздуха в объемном отношении 1:1. После атого выделяют чистые культуры бактерий.

Пример 1. Для выделения метанокисляющих бактерий берут 1 r пробы поч-, вы из донного отложения вблизи берега занадного побережья Шенэе, в местности расположения института лимнологии имени

Макса Планка и вносят ату пробу в жидкую минеральную питательную среду, опи санную выше.

Полученную смесь культивируют в феро ментере емкостью 200 мл при 27 С в газовой среде, состоящей из одной объемной части метана и одной объемной части воздуха.

По истечении трех дней появилось на питательной среде плотное бактериальное разрастание, обнаруживаемое с помощью микроскопа.

Полученную культуру пересевают на минерально-агаровую среду и в течение пяти дней продолжают процесс культивирования в среде метана и воздуха, взятых в укаэанном отношении, до образования на поверхности видимых под микроскопом колоний. Из полученной популяции бактерий вы деляют единичные клетки в капельках питательной среды. Их обрабатывают указанной смесью метана и воздуха. Спустя пять дней из находящихся в капельках питательного раствора единичных клеток образовались чистые культуры бактерий (штамм

М 102). Их выделяют известным обра» зом. Установлено, что иэ 1 вес.ч. метана образовалось 0,8-0,9 вес.ч. бактериаль ной культуры, Пример 2. Для получения харак- теристики культуры, полученной в примере

1, из соединений, приведенных в табл. 1, готовят субстраты в виде 1%ных растворов в минеральной питательной среде.

Полученным субстратом .прививают иопытуемую- культуру - штамм М-102 метан-окисляющих бактерий.

Спустя 3,7 и 21 день с начала культивирования проводят испытания. Результаты приведены в таблице. При атом обозначают знаками: — никакого использования субстрата

+ слабое использование

+ весьма заметное использование.

615871

Субстрат арабиноза лактоза мальтоза сахароза крахмал целлюлоза

Спирты: метанол метанол пропенол бутанол бензол

Альде гиды: муравьиная уксусная пропионовая глицин цистин алании фенилаланин изоамиловый формальдегид ацетальдегид бензальдегид

Жирные кислоты:

Аминокислоты:

Обычные субстраты: образование индола б

Продолжение таблицы

Изменения спустя, день

7 21

61587 1

Продолжение таблиць;

Изменения спустя, день

Субстрат

21 проба на метилрот катала за о ..с де;а

Ме Ссл е» Бг.-. ;. Е (бульон) лакмусовое молоко разжиженная желатина

Из приведенных в таблице данных вид но, что из всех опробованных питательных сред подверглись значительному распаду 25 (были использованы) жирные кислоты и ряд сред потреблялись слабо, в частности . из спиртов-метанол. Это говорит о специфичности испытуемой культуры только к одному виду, источника углерода - метану, 30

Пример 3. Готовят растворы субстратов путем добавки органических соединений в концентрации 1% к жидкой минеральной питательной среде указанного типа.- 35

В полученный раствор субстрата засевают испытуемую культуру штамм М-102 и культивируют при рН 7, температуре

27 C в ферментере при встряхивании. о

Для сравнения эту же культуру засевают на аналогичную питательную среду, но без органических добавок, а культивирование ведут в присутствии смеси метана и воздуха, взятых в соотношении 1:1.

Пробы отбирают спустя 3,5 и 7 дней, В результате было установлено, что испытуемый IllTBMM М-102 - специфичный в отношении метана.

Пример 4. Проводят испытания штамма М-102 на цветные пробы. Полученные результаты приведены ниже:

Проба (тест)

Окрашивание: по Граму Отрицательное 5 по кислотности Отрицательное спор Отрицательное жгутиков Отрицательное капсул Отрицательное

Таким образом, можно сделать вывод, что в испытуемой культуре отсутствуют акце пторы, Пример 5, Определяют активность окисления метана штаммов М-102. Для этого в ферментер емкостью 5 л вводят

1 л жидкой минеральной среды указанного типа и засевают испытуемую культуру, культивируют при 27 С в присутствии смеси метанола и воздуха в отношении

1:1 по объему. Выход полученной через

5 дней культуры составил 1,5 г, что в пересчете на израсходованный метан составляет 0,8 вес.ч. культуры на 1 вес,ч. метана.

Пример 6. Засеянную по приме ру 5 среду культивируют з ферментере ем- костью 5 л при встряхивании при 27"С в присутствии смеси природного газе и воздуха в отношении 1:1 по объему.

Концентрация культуры, полученной через 5 дней, составила 1,5 г сухого ве шества.

Культуру отделяют от питательной среды и определяют ее состав. Установлено, что на 70% она состоит (пб сухому веществу) из протеина, остальное — углеводы, липиды и составные части клеточных стенок.

Выход культуры в пересчете на метан составил 0,8 вес,ч. сухой массы бактерий из 1 вес.ч. природного газа. На дыхание израсходовано 20% газа, Это соответствует наибольшему выходу, достигнутому когда-либо.

Пример 7. Опыт аналогичен примеру 6, но культивирование ведут в сме9, 615 си метана и воздуха, состоящей иэ 58об.Ъ воздуха и 41 об.7 метана. В смеси.содержалось 11,8 об.% кислорода (т.е.смесь находится вне границ вэрывоопасности) .

При атом были предусмотрены все другв. меры безопасности, предусмотренные при работе с газам в помещении (снабжение коммуникаций предохранительными клапанами для избыточного давления, вынос фер ментера иэ основного помещения в специlO альное, установка контрольных и сигнальных приборов и т. д.).

Во время культивирования метан и воэ дух подают последовательно, точками с соблюдением интервалов, и зависимости.

35 от выхода (при выходе 28 г/л относительно сухого вещества биомассы продолжитель ность подачи газа-4, мин, интервал выдержки-12 мин.

Содержимое ферментера подвергают не-2О прерывному анализу, удаляя замедляющие рост продукты.

Выход биомассы составил 28 г/л пи тательной среды, Приведенные примеры подтверждают 25 эффективность получения метан-окнсляющих бактерий по предлагаемому способу.

Формула и зобретення

Способ получения метан-окисляющих бактерий, предусматривающий внесение

871

10 пробы почвы в жидкую минеральную питательную среду, содержащую двухэамешен» ный фосфорнокислый калий, сернокислый магний в количестве 0,2 г/л и следы хлорного железа, культивирование ее в присутствии смеси метана и воздуха, вэя» тых в соотношении 1:1, пересев получен ной культуры на минерально-агаровую среду с последующим культивированием на этой смеси и выделением бактериальной культуры, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и полу чения бактериальной культуры, обладаю шей высокой активностью, используют почву, выделенную из донного отложения пограничного биотона, а в жидкую минерал ную питательную среду дополнительно вно сят на 1 л питательной среды 1 мл pacr. вора, содержащего на 18 л дистиллирован ной воды следующие компоненты, г: хло ристый литий 0,5, пятиводный сульфат ме ди 1,0, семиводный сульфат цинка 1,0, . борную кислоту 11,0, сульфат аммония

1,0, гидрат хлористого олова 0,5, шести» водный сульфат никеля 1,0, четырехвод ный хлористый марганец 7,0, шестивод ный нитрат кобальта 1,0, окись титана

1,0, йодистый калий 0,5 и бромистый калий 0,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. "Микробиология", т. 38, вып. 2, 1969, с. 251-257.

Составитель М. Андреева

Редактор Т. Деватко Техред Е. Давиаович1Корректор И. Гоксич

Заказ 3802/48 Тираж 568, Подписное

ИНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам иэобретеняй и открытий 113035, Москва, )f9 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4