Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социал истииескии

Расяублик (6)) Дополнительное к авт, саид-ву— (51) М. Кл. (22) Заявлено 28.03.77 (21) 2469453/28-13

С 12 Э 13/06 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано15.08,78. Бюллетень №30 (45) Дата опубликования описания 03.07.78

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретеиий и открытий (53) У ДК 61 5.4 5:

:547.963.32 (088.8) (72) Авторы изобретения

Г. Ф. Леванова и И. П. Евсикова (71) Заявитель

Горьковский научно-иссдедоватепьский институт эпидемиологии и микробиопогии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ

КИСЛОТЫ

Изобретение относится к области медицинской химии, а именно молекулярной биопогии микроорганизмов.

Известен способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты путем вырашивания микроорганизмов на питательной среде с поспедуюшим смывом и суспензированием биомассы в трис-(гидроксилметил)-аминометановом буфере, детинтеграцией биомас- сы в замороженном состоянии, повторным 0 суспендированием в буфере, депротеиниэацией свежеперегнанным фенопом, выдепением и очисткой целевого продукта (1).

Белью изобретения является попучения дезоксирибонуклеиновой кислоты из дифтерийных коринебактерий.

Эта цель достигатеся тем, что смыв и суспендирование биомассы ведут при температуре роста микроорганизмов в присутствии трипсина, суспензию биомас сы перед дезинтеграцией выдерживают в течение 2 ч при 36-37 С, а депротеиО низацию ведут 50-70%-ным раствором фенола. Повторное суспендирование биомассы ведут при соотношении биомассы и буфера 1:4.

Пример. Дифтерийные коринебактерии (как токсигенные, так и нетоксигенные) нарашивают в матрицах на 2,5%ном мартеновском агаре с 1%-ной нормальной пошадиной сывороткой в теро мостате на 37 С. Смыв клеток произвоо дят с неохпажденных матрацев (37 С) теплым (37 С) 0,1 М (оксиметип ипи гидрооксиметип) аминометановым трис-буфером, рН 7-8, с добавлением трипсина до конечной концентрации 500 мкг/мл, т.е. культура во время смыва находится при температуре ее вырашивания. Полученную суспензию тепповых клеток предваритепьно выдерживают в термостате при 37 С в течение 2 ч,а затем центрио фугируют 20 мин при 5000, об/мин (при механическом способе разрушения бактерий выдерживание в течение 2 ч не обязатепьно) °

Дальнейшая обработка бактерий может идти двумя путями:

619509

55 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Биомассу свежих клеток после замораживания при (-40 С) подвергают однократному продавпиванию через шепь

20-25 мкм при температуре пресс-формы равной (-40) С под давлением 20 атм.

Разрушенную массу суспензируют в растворе, содержащем 0,15, (мопь) хлористого натрия и 0,1 (моль) динатриевой солй этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭК7А) рН 8,0- 8,5 ипи в указанном выше буфере, в отношении 1:4 (к 1 г спрес10 сованных клеток добавляет 4 мл раствора). После встряхивания в течение 30 мин суспензии с равным 50-70%-ным объемом свежеперегнанного спабошепочного фенола в бане со льдом (к 60 мл расплав15 пенного фенола добавляют 40 мл указанного раствора и доводят до рН 8,0-8,5, 50%-ным раствором едкого натра), производят центрифугирование в течение

40 мин при 5500 об/мин иа холоде. го

Верхний спой, содержащий извпеченные нукпеиновые кислоты, подвергают, кроме того, еще одной хлороформенной делротеиниэации, т. е. заливают равным объемом смеси хлороформ - изоамиповый спирт

25 (24:1) и взбалтывают в течение 20 мин.

Разделение слоев осуществляют с помощью центрифугирования в течение 30 мин при 5000 об/мин. Из BHOBb образовавшегося верхнего слоя нукпеиновые кислоты осаждаются двойным объемом этилового спирта. Медузообраэный осадок после промывания в 70%-ном этанопе растворяют в стандартном сопевом растворе ССР (0,15 М NaC1 + 0,015 N цитрат натрия) 35 и обрабатывают предварительно прогреО той в течение 10 мин при 80 С рибойукпеаэой (P HK — .азой) фирмы " R e a @a R в конечной концентрации 200 мкм/мл в течение 1 — 1, 5 ч при 37 С. Затем проводят обработку провазой (фирмы, Мейгс ") в концентрации 100 мкг/мл в течение 1-1,5 ч при 37 С. После охлаждения смеси дальнейшую очистку

ДНК осушествпяют путем многократной хнороформенной обработки до исчезновения среднего белкового слоя между водной и хпороформенной фазами (не менее

3 раэ), Верхний водный слой, образовавшийся в результате конечного центрифугирования, запивают двойным объемом этанола. 0фор мившийся осадок QHK промывают в 70% атанопе, растворяют в 0,1 M ССР и после добавления раствора ЗМ ацетата натрия с 0,001 М ЭДТА (рН 7,0) проводят дополнительное осаждение изопропаЦНИИ!l И Заказ 437 9/22 иолом для более тщательной очистки от белков и полисахаридов, Описанный способ позволяет получать свыше 1 мг ДНК из 1 r спрессованных клеток дифтерийных коринебактерий.

Клетки, собранные по предлагаемому способу, заливаются атайопом на сутки и более, а затем ДНК из них выделяется по методике А и4д. 4сtaE (1968), за тем исключением, что вместо проназы при пизисе клеток используют трипсин вдвое большей концентрации (т.е.

200 мкг/мл), а додеципсульфат натрияв четыре раза (т. е. 1%). Кроме того, фенольная обработка должна повторяться не менее трех раэ; каждый разсдобавпением новой порции раствора, содержашего 0,15 М:ХаС1 + 0,1 М ЭДТА (рН 0,8-8,5) в количестве, равном отобранному верхнему слою, образующемуся после центрифугирования-.

Предлагаемый способ позволяет получать ДНК из дифтерийных коринебактерий, из которых с помощью обшепринятых методик QHK не выделялась, прн атом обеспечнваетсясохраненне дезоксирибонукпеиновой кислоты в коринебактериях от разложения собственными нуклеаэами и от химическойдеградацин в процессе извлечения.

Формула изобретения

1, Способ попучения дезоксирибонуклеиновой кислоты путем выращивания микроорганизмов на питательной среде с поспедуюшим смывом и суспендированием биомассы в трис- (гидроксилметип)аминометановом буфере, дезинтеграцией биомассы в замороженном состоянии, повторным суспендированием в буфере, де п ротеин изацией свежепе рег раиным фен олом, выделением и очисткой целевого продукта, о т и и ч а ю ш и и с я тем, что, с цепью получения дезоксирибонуклеиновой кислоты из дифтерийных коринебактерий, смыв и суспендирование био массы ведут при температуре роста микроорганизмов в присутствии трипсина, суспензию биомассы перед дезинтеграцией выдерживают в течение 2ч при

36-37 С, а депротеинизацию ведут 507 0%-ным раствором фенола.

2. Способ поп. 1, отп ич аюш и и с я тем, что повторное суспендирование биомассы ведут при соотношения биомассы и буфера 1;4.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: . 1. Авторское свидетельство СССР № 470531, кл, С 12 2 13/06, 1972.

Тираж 568 Подписное