Способ определения осахаривающей способности амилолитических ферментов

Способ определения осахаривающей способности амилолитических ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИ--В

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

lt d

Союз Советскнх

Соцналнстнчесюа

Республнк

К АВТОРСКОМУ СВИДВТВЛЬСТВУ(6l) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено 16.07.77%) 2463868/28-1Э с нрнсоеднненнеее заявки М(23) Приоритет

2 (5е) М. Кл.

601 Н ЭЭ/14

Гесуйаретееааб метет

Вееете Мкнеетрее ИСр ее лееен кеебретееек я еткрепе» (43) Опубликовано15.08.78.бюллетень Ж Э (53) УДК 557.154 (088. 8) (45) Д,ата опубликования описания Э0.06.78 (72) Авторы. нэобретення

В. С. Чередниченко и А. П. Рухлядева

Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ OCAXAPHBAKUlEA

СПОСОБНОСТИ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ (К дП+ 0 0104) ° 1000(100) и и(п ) Известен способ определения осахарн- ваюшей способности амилолнтнческих ферментов, предусматрнваюший ферментатнвный гидролнэ исследуемой пробы, инактивирование ферментов соляной кисло- 5 той, осажпение белков и осветление раствора н определение образовавшихся сахаров с последуюшим расчетом их количества 11) .

Недостатком известного способа "является то, что определяют сумму всех углеводов, а расчет осахарнваюшей способности производят по какому-либо одному углеводу-глюкозе или мальтозе, преобл@- 1е дакепему в растворе в большом количестве. Это приводит к занижению или завышению значения осахарнваюшей способ ности. Кроме того, известный способ применяют только для анализа ферментов 20 микробного происхождения.

Целью изобретения является повыше!вне точности н воэможности контроля осахариваюшей способности амилолитических ферментов различного происхождения. 1S

Эга цель достигается тем, что в предлагаемом способе определение образовавшихся сахаров осуществляют поляриметрическим методом при длине нолти

400-450 мм в пве стадии, первую из которых проводят перед ферментативным гидролнзом в исследуемой пробе, а втррую — после него, а расчет количества сахаров ведут по формуле где ОС и - осахариваюшая спосабностЦ, К и 0,0104 коэффициенты, установленные экспериментально, причем К = 0,0838 и О,0777, lj (ll ) количество препарата, взятого иа анализ, мг (мл);

1000(100) - коэффициент перевэда иэ мг в г на 100 мл жидкого продукта;

- разность оптического враш ння растворов, полученных на I и Q стадиях.

619856

Э

Осаждеиие белков и осветление раствора проводят перед поляриметрическим методом определения образовавшихся сахаров в растворах сернокислым цинком и ферроцианидом калия.

Сущность способа заключается в сле1 дующем.

В пробирку наливают последовательно

10 мл раствора, 1 мл lн раствора соляной. кислоты, по l мл осадителей (30%-ный раствор сернокислого цинка

tÎ и 15%-ный ферроцианнд калия) и 20 мл субстрата. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют. Затем определяют в полученном растворе поляризацию на автоматическом поляриметре в трубке

15 длиной 200 мм при jl = 400-450 им=а стадия поляризации, Пк.

Одновременно проводят ферментатив,— ный гидролиэ исследуемой пробы при температуре 50 С и рН =4,8-4,9 (фосфатный буфер для солодов) и 4,7 (ацетатный буфер для t рибов), продолжитель/ность реакции 30 мин, объем реакционной смеси 30 мл (20 мл субстрата и

10 мл ферментного раствора). Для анали- gg за берут пробирку размером: диаметр

18 мм, длина 180. мм. Наливают в нее

20 мм субстрата и ставят в ультратермос тат (или водяную баню) с постоянной температурой . 50 С + 0,2 С.

В термостате пробирку выдерживают в течение 5-10 мин для того, чтобы раствор в ней принял температуру, при которой будет проведена ферментативнареакция. Затем наливают в пробирку, находяшуюся в термостате,l0 мл рабочего ферментного раствора, также подогретоо го до 50 С (солодовой вытяжки, осахаренного сусла, бражки и т. д.), перемешивают и оставляют стоять в термоста те 30мин.

По истечении этого времени пробирку вынимают из термостата, добавляют

1 мл 1 н раствора соляной, @кислоты для инактивирования ферментов. Для осаждения белков и светления раствора гидролиэата приливают 1 мл 30%-ного.раствора сернокисло о цинка, а через некоторое время остаток сернокислого цинка удаляют прибавлением 1 мл 15%-ного раствора желтой кровяной соли.

В полученном гидролизате определяю1 поляризацию при той же длине волныстадия. Разность между значениями вращения плоскости поляризации, полученными на 1 и g стадиях, показывает значение снижения поляризации (A П) °

Осахаривающую способность рассчитывают по формуле, представляя в них измеренную величину. (К ЛП+ O,0104) 1000 (100) и n (n ) где К 0,0838, 0,0777 и 0,0104 - коэффициенты

I установленные экспериментально !

Р

tt(n ) — количество препарата, солода или жидкого продукта, взятого на анализ, мг (мл);

1000(100) - коэффициент перевода иэ мг в г, и на 100 мл жидкого. продукта, g П - разность оптического вращения растворов, полученных на Х и стадиях.

Пример 1. На анализ взят зеле,ный ячменный солод. Приготавливают ос новной раствор — 5 t в 90 и дистиллированной воды и 10 мл буферного раствора. Основной раствор разбавляют в 25 раэ. Следовательно, количество солода

1ч в мг, взятое для анализа, равно

5 4 10 1000

100 100

В исследуемой пробе осаждают белки и оставляют раствор сернокислым цинком и ферроцианидом калия, а затем поляриметрическим методом при длине волны

400 нм определяют образовавшиеся саха- ра, получая при этом оптическое вращение раствора, равное 8,98 (Пк).

Исследуек ую пробу подвергают ферментативному гидролизу, затем в ней

4 инактивируют,ферменты соляной кисщьтой. осаждают белки и осветляктг раствор аналогичным образом.

После этого проводят вторую стадию определения образовавшихся сахаров по» ляриметрическим методом при тех же параметрах, при этом оптическое вращение раствора составляет - 8,26, (По).

Определяют разность оптического вращения. 11 Ц gg =g gg,o 7 o

Подставляем tt и ьП в формулу (0,0777 0 72 + 0 010Ф) 101

ОС . ;3,И urn,ед/г

Влажность солода 40%.

Осахаривающая активность на абсо лютно сухое вещество главна:

З,Зг 10О

pp = — = 5,53 ed./ã

100-.40

Пример 2. На анализ взж сусло, осахаренное глюкобататином ГХ

619856

10 10 и = — =1,0пл

iO00

Подставляем значение в формупу

Составитель Л. Пашинииа

Техред Э. Чужик Корректор Н. Ковалем

Редактор Т. Оевятко

Заказ 4499/41 Тираж 1112 Пonписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Советс Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г, Ужгооод, ул. Проектная, 4

Ь

Фильтрат сусла разбавляют в 10 раз. На анализ берут

Измерение оптического врашения раст- воров производят на автоматическом попяриметре, получая значения п„ и, Фв; и 10,84) an eo,б+.

Ос. (0)0838 ° О)64+ О,ОНИ) 1ОО

=6,416д 1аоюл.

Предлагаемый способ позволяет повысить точность и воэможность контроля

15 осахариваюшей способности амилопитичес— ,ких ферментов различного происхождения.

Формула изобретения

Способ определения осахариваюшей способности амилолитических ферментов, предусматриваюший ферментативный гидролиэ исследуемой пробы, инактивирование ферментов соляной кислотой, осаждение белков и осветление раствора и определение образовавшихся сахаров с последуюшим расчетом их . количества, о т л и— чаюшийся тем, что,сцепьюповышения точности и возможности контроля осахариваюшей способности амилолитических ферментов, различного происхождения„,определение образовавшихся сахаров осушествляют попяриметрическим методом при длине волны .400-450 нм в две стадии, первую из которых проводят перед ферментативным гицролизом в исследуемой пробе, а вторую — после него а расчет количества сахаров ведут по формуле (К Ла+О,ас ) 1ЮОО(1ОО) и Л (Л ) где ОСп- осахариваюшая способность;

К и 0,0104 — коэффициенты, установленные экспериментально, причем

К = 0,0838 и 0,0777; (п ) - количество препарата, взятого на анализ (мг или мп)

1000(100) - коэффициент перевода из мг в г на 100 мл жидкого продукта; жП вЂ” разность оптиче ского врашения растворов, полученных íà I и 3 стадиях

2. Способ по. п, 1, о т и и ч а ю—

m и и с я тем, что осаждение белков и осветление раствора проводят перед попяриметрическим методом определения образовавшихся сахаров в растворах с5рнокислым цинком и ферроцианидом калия.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Бурштейн А. И. Методы исспедоф вания пишевых продуктов". Киев, 1963 с. 435-439.