Способ получения антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

5 г. с-со неуи@„

О П И C A Н-N--" -":Fe"

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советскик

Социал истицескик

Республик

{61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 29.09.76 (21) 2404253/28-13 (51) М. Кл. (23) Приоритет - (32) 02. 10.75 (31) 619107 {331 США

С 12 Э 9/00

Гаоумротаенный наинтет

Совета Мнннотроа СССР но делам нзооретеннй н отнрытнй (53) УДК 615.45

:615.779.932 (088. 8) (43) Опубликовано15.08.78.Бюллетень № 30 (45} Дата опубликования описания 29.06.78

Иностранцы

Марвин Мартин Хоен (США) и Карл Хайнц Михель (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

Эли.Лилли анд Компани (7l) Заявитель

ССША ). (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА т ОБЛАДАЮШЕГО ПРОТИВОГРИБКОВОЙ

АКТИВНОСТЬЮ /

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству антибиотиков, Предлагаемые антибиотики новые и в патентной и научно-технической литературе не описаны.

Предлагаемый способ получения антибиотичесхого комплекса, . обладающего противогрибковой активностью, состоит в том, что штамм Аьрещч1Имь ищойоьие ИЯЮ

8113 выращивают в аеробных условиях .

:на питательной среде, содержащей истоъники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого про-. дукта и разделением его .на компоненты.

Штамм АврегрЮОЬ vvguf osve NR@4g113 выделен из почвы, взятой в развалинах

Помпеи, Италии, и хранится в коллекции культур исследовательской лаборатории северных районов Министерства сельско-. го хозяйства США, служба сельскохозяйственных исследований, Перрия, Иллинойс

61604 под номером МЙЙ 8113 и харак теризуется следующими свойствами.

Агар Чапека. Культура растет медьен» но, достигая 1,5-2,0 см в диаметре за

15 дней при 25 С. Поверхность колонии выпуклая и, бархатистая, она сморшивает»5 ся со временем в центре и затем стано,вится выпуклой. Периферия мицелия пред. ставляет собой полосу шириной 2 мм глубоко погруженных бесцветных гиф к яв-, ляется извилистой. На концах воздушных

10 гиф образуется розовато-хоричневый эксудат. Образует бледно-пурпурный растворимый пигмент.

Через 5 дней поверхность колонии приобретает окраску от белого до желто)5 вато-коричневого цвета, обратная сторона колонии коричнево-оранжевая в центре и коричневатая до коричнево-пурпурной на. периферии. Через 10 дней колония ум ренно желтовато-розовая. Через 14 дней.

2С колония становится светло-серо-красной.

Концевая поверхность становится бородавчатой и ярко-желтой. На поверхности и по концам колонии возникают беспоря- . дочно распространенные темно-желтые

И пучки оболочек клеток. Со временем ярко

620215 желтые бляшки и концевая поверхность становится желто-зелеными. Через 3 нвд. наблюдается оранжево-пурпурный тон на новых поверхностных концевых компонентах. Сначала обратная сторона колонии слегка вогнута. По мере старения колония становится плоской к поверхности

arapa и обратная сторона ее слегка смор щивается. Через 10 дней обратная сторона становится светло-коричневой, через

15 дней - серовато-красной.

Конидиофоры разбросаны по поверхности, иногда в виде бляшек или в полу погружной полосе. Головки конидий сначала лучистые и сферические; со временем онн могут развиться в виде коротких столбиков, которые более компактны.

Сферические головки диаметром 70-80 мкм, всрепнем 50 мкм. Столбчатые головки имеют длину до 140 мкм, ширину 70 млм, Конидии сферические до полусферичес

«их, мелкоскладчатые, зеленовато-золотж- тые в массе. Их диаметр 2,8-3,9 мкм, всреднем 3,,2 мкм. Стеригмы бесцветные.

Длина первичных стеригм составляет

4,7-11,0 мкм, в среднем 7,9 мкм. Р наиболее широкой точке они имеют 2,4 Мкм

;и сужаются до 3..6 мкм.

Вторичныв стеригмы могут возникать одинарными или парными, они получаются из первичных, имеют плоскую форму.

В наиболее широком месте имеют раэме ры 3,0 мкм и сужаются до О,4 мкм, где они становятся трубчатыми. Трубча тый кончик имеет длину 1,2 мкм. Обшая длина составляет 5,5-12,6 мкм, в срей нем 9,2 мкм.

Везикулы сферические до полусферических, они могут быть апикально плоокими, становясь со временем коричнеными. Их диаметр 7,4-11,2 мкм в сред-, нем 9,4 мкм.

Конидиофоры гладкие, сравнительно толстостенные, вначале они гиалиновые, затем переходят в светло-коричневые.

Они слегка шире в везикуле и могут слег- 5 ка сходиться на конус близ ножки клвт ки. Средняя ширина 5,9 мкм. Конидиофо ры имеют длину 47,7-166,6 мкм, в среднем 106 мкм. Они возникают из потружных гиф или горизонтально из воздушных ур гифовых нитей.

Аскогвнное состояние наблюдается через 20 дней. Небольшие желтоватые пучки оболочек клеток, воэникаюшие на поверхностию можно найти на любом Jpori» 55 нв мипелия. Они состоят из оболочек

«лвток, внутри которых находится одна

Или несколько клейстотепиев. Оболочки клеток шаровидные, полушаровидные, овальные или уплиненные, они толстостен« ные и гиалнновые. Диаметр шаре видных оболочек клеток составляет 18-24 мкм, в среднем 21,8 мкм.

Клейстотецин шаровидные до полушаровидных, толстостенные сравнительно вязкие и волокнистые. Вначале сравнительно бесцветные, онн "тановятся красно-пурпурными и темнеют со временем.

Их диаметр 165-470 мкм, в среднем

275 мкм.

Агар с солодовым экстрактом. Колонии о растут при 25 С, быстро расширяются, постигая 4-5 см за 10 12 дней. Сначала серо-белые, колонии становятся умеренно оливково-зелеными через 4 дня.

Небольшие желтоватые пучки оболочек кле»ток расположены пунктиром по краю и беспорядочно разбросаны по фетроподобной поверхности агара. Через 20 дней эти пучки оболочек клеток покрывают коркой большую часть поверхности. Обратная сторона колонии серовато-желтая. Через

15 дней образуется аскогенное состояние.

Небольшие желтоватые пучки оболочек клеток, образующиеся на поверхности, можно обнаружить на любом уровне в мицелии., Они состоят ив оболочек кле ток, внутри которых находится одна или несколько клейстотециев. Оболочки кле»ток могут покрывать коркой большие пло щади над головками конидий. Оболочки клеток шаровидные или полушаровидные, овальные или удлиненные толстостенные д гиалиновые. Диаметр шаровидных обоночек клеток составляет 18-24 мкм, в среднем 21,8 мкм.

Клейстотеции шаровидные или полуша-ровидные, они окрашены в темно-краснокоричневый цвет. Диаметр 389-700 мкм, в среднем 506 мкм.

Аски хрупкие, гиалиновые, полушаровидные до овальных. Диаметр полушаровидных аск составляет 8,7-11,9 мкм, в среднем 10,3 мкм, Размер овальных иск 10,3-14,2х8,7 - 1.0,3 мкм, в сред нем 12,2Х9,1 мкм.

Аскоспоры красно-оранжевые, мелкоскладчатые с двумя параллельными тонкосплетенными экваториальными гребешками, ширина которых до 0,8 мкм.:;Аско» споры выглядят двояковыпуклыми по продольной оси. Если гребешок периферийный, то аскоспоры шаровидные. Диаметр шара 4,9-6,3 мкм, в среднем 5,4 мкм.

Указанный штамм можно выращивать на питательных средах, содержаших ис»точники yrrreporra, например глюкозу, мелассу, крахмал, лактоэу, сахарову, мальтозу, глицерин, источники азота, напри6202 15 8 диэтиловому афиру (15 обьемов). Образовавшийся осадок отделяют и сушат, получают 23 мг компонента Д антибиотика

A-30912. Фрахции с 274 по 473 содержат компоненты А, В, С и Д антибиотиza А-30912. Фракции с 482 по 900 содержат компоненты А, Е, Г и G антибиотика А-30912. Фракции с 438 по 481 объединяют и упаривают в вахууме, получают масло. Это масло растворяют в небольшом объеме метанола, метанольный створ добавляют х диатиловому афиру

15 обьемов). Образовавшийся осадох отделяют и сушат, получают 2,17 r компонента А антибиотика А-30912.

0,004

Ацетонитрил-вода (4:1)

Ацетонитрил-вода (7:3), мадза чн,о 1,0 ксе 0,5

Са СО 2,0

Feso4 Н О (растворенное в

2 мл концентрироой НСЕ )

Деи они зированная вода до, л 1,0, После стерилизации в автоклава при о

121 С в течение 30 мин при давлении

1,05-1,1 атм рН среды 6,8. Инокулиро ванную среду ферментируют в ферментао торе емкостью 165 л при 25 С в тече ние 4 дней. Ферментационную среду продувают стерильным. воздухом при расходе

0,5 объем/объем/минЛ; Ферментационную среду перемешивают обычной. мешалкой при 300 об/мин. . 200 л культуральной жидкости тшательно перемешивают с 200 л метанола в течение 1 ч, затем отфильтровывают на фильтре из диатомовой земли, рН фильтрата доводят до 4 с,помошью 5н.НС8.

Подкисленный фильтрат экстрагируют дваж ды равными: обьемами хлороформа. Хлороформенные акстракты соединяют вместе и упаривают в вакууме до обьема около

4 л. Этот концентрат добавляют к 60 л диатилового афира для осаждения смеси

А-30912. Осадок отделяют фильтрованием, его высушивают и получают 38 г смеси антибиотика А-30912 в виде серо-

ro порошка. Фильтрат упаривают в вакууме и пслучают масло; это масло растворяют в 500 мл метанола. Метанольный раствор добавляют х диатиловому афиру (7,5 л) для осаждения дополнительного количества антибиотика -30912. Осадок также отделяют фильтрованием, сушат и получают еше 3,5 r антибиотика А-30912.4О

Пример 2. Выделение компонента

А антибиотика А-30912.

Комплекс антибиотика А-30912 (20 г) вводят в силикагелевую колонку (4 4107 см), в смеси вцетонитрил-вода (95:5). Колон- 4у ку алюируют смесью ацетонитрил-вода (95:5) при расходе 1-2 мл/мин собирают фракции обьемом около 20 мл. Эти фрак-, ции проверяют тонкослойной силикагелевой хроматографией, применяя смесь ацетонив-.So рил-вода (95:5) и биоотметку CQhc3iC!Ocl<

t)icons . Фракции с 74 по 125 соединяют вместе и упвриввют. Концентрирован ный раствор кристаллпзуют и получают

124 мг стеригматоцистинв. Фракции с у

212 по 273 соединяют вместе и упариввют в вакууме, получают масло. Это маоло растворяют в небольшом объеме метанола. Метанольный раствор добавляют к

Частично очишенный антибиотик

А-30912, содержвший компоненты В, С, и Д антибиотика А-30912 (750 мг) из фракций 274-437 хроматогрвфируют на силикагелевой колонке (2,2Х51 см), собирают фракции объемом около 1 мл и алюируют следуюшими растворителями;

Фракция:

1»25 Ацетонитрил

26-62 Ацетонитрил + 1% воды

63-700 Ацетонитрил + 1,5% воды. ч ракцни из колонки контролируют силикагелеиой тонкослойной хроматографией, примения смеси ацетонитрил-вода (95:5) и бензол-метанол (7:3) и биоотметкуСсй 81 > QH)1Goltls . Фракции 535-685, в которых содержится компонент Д антибиотика А-30912, объединяют, выпаривают в вакууме до масла. Это масло растворя ют в небольшом объеме метанола и добавляют к диатиловому афиру (15 обьемов).

Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, сушат и получают 69 мг компонента Д антибиотика А-30912.

Частично очншенный комплекс антибиотика А-30912 (18 г), содержащий компоненты А В, С и Д -30912 и фракций 212;437, растворяют в минимальном объеме смеси ацетонитрил-вода (4:1) и хроматографируют на колонке с окисью алюминия (3,8Х56 см) собирают фракции объемом около 20 мл. Колонку элюируют следуюшими растворителями:

Фракции:

1-300

301-5 09

Фракции из колонки проверяют силиквгелевой тонкослойной хроматографией, как описано выше. На основе этих данных фракиии объединяют и упвривают до л.:.:.ола, масляные остатки растворяют в не620215

6-28. С,Д

5,80

34-114

2,90

1 15-164

165 509

А,В

1,20

1,90

Табли ца 2 ты комплекса

0,250

09015

341-47 9

480-540

541-899

900-167 5 0,3.91

0,340 большом количестве метанола, метанольные растворы осаждают 10-15 обьема« ми диэтилового эфира. Способ соединения

Для получения очишенного комплекса

С часть фракций 6-28 (2 r) растворяют в метаноле, сорбируют на достаточном количестве силикагеля, сушат и вводят в верхнюю часть силикагелевой колонки (1,9)(80 см), заполненной ацетонитрилом.

Колонку элюируют ацетонитрилом, подаваемым.с расходом 2 мл/мин, собирают фракции обьемом около 10 мл.,H6» фрак ции 1-17 растворитель меняют на смесь

Компонент А антибиотика А-30912, Обладйюший прОТЯВОгрибкОвой вктивнОстью, 4 имеет:

Эмпирическую формулу 5»,5Н и-вР70»7Элементарный состав, %:

С 56,52

Н 7,29

М 868

0 27,09

Молекулярный вес 1100. (4.1р -44 (Г 0,5;СН ОН)

».аД = -156 (C 0,5;СН ОН)

Максимальные частоты поглошения в ультрафиолетовом спектре (в кислом и нейтральном метаноле) 225, 275, 284 нм, в»м;но»»»»ол» метаноле 245 и 290 нм, фракций, вес полученного вешества и содержание компонента в соединенных фрак цяях приведены в табл. 1.

Таблица 1 ацетонитрил-вода (99:1). фракции из колонки контролируют тонкослойной хроматографией. На основе данных тонкослой ной хроматографии фракции объединяют, выпаривают до маслянистого остатка, маслянистые остатки растворяют в неболь шом обьеме метанола, метанольные растворы осаждают 10-15 обьемами диэтилового эфира. Содержание компонентов и вес фракций приводятся в табл. 2.

Максимальные частоты поглошения в инфракрасном спектре (КВг ):

2,97 (сильный), 3,39 (средний), 3, 47 (слабый), 5,99 (сильный),6,10 (сильный), 6,49 (средний), 6,56 (сред= ний), 6,90 (средний), 8,00 (слабый), 9,13 (слабый), 11,77 (слабый) мкм.

Максимальные частоты колебаний при ядерномагнитном резонансе (в пердейтерометаноле):

Р 176,1, 174,3, 173,4, 172, 7

169 8 158ю4» 13298е 130з9 129е6, 129,0, 116,2, .77,0, 74,4, 75,7, 71,3, 11 62021

27,0, 26,5, 23,6, 20,1 19,6, 14,4 и

11,3 ч/млн.

Титруемую группу с величиной р Кд

312,8 (начальное рН 6,9) в 66 М-ном водном растворе диметилформамида.

Белое аморфное вещество, растворимое в полярных органических растворителях, например метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этидацетате не растворимо в неполярных органических растворителях, например диэтиловом и петролейном эфирах.

Компонент Д антибиотика А-30912, обладающий противогрибковой активностью имеет;

Элементарный состав, %:

t5, С 56,37

Н 8,17

8, 54

0 26,92

Молекулярный вес 1100.

20 с ж „о (. 0 34, С Ощ

Максимальные частоты поглощения в, ультрафиолетовом спектре (в кислом и

:нейтральном метаноле) 225 и 275 нм, в основном 240 и 290 нм.

Максимальные частоты поглощения в инфракрасном спектре (КВг ):

2,98 (сильный), 3,31 (слабый), 3,3

{плечо), 3,40 (средний) 3,48 (слабый), 5,76 (слабый)в 6,01 (сильный), 6,10 (плечо в 6,49 (средний), 8,57 (средний), 6,90 .(средний),7,81 (слабый) 8,07 (слабый), 9,16 (слабый).

Белое аморфное вещество, растворимое и метаноле, этаполе, диметилформамиде, диметидсульфоксиде, этидацетате, в водном растворе, особенно с рН больше

7,0; не растворимо в диэтиловом эфире и петролейном эфире.

Компонент В антибиотика А-30912 4э имеет:

Элементарный состав, %:

С 57,36 Н 5,92

8,75

О 261 с изб = -170 (C 0,5; Сн Сц)

-3= (Максимальные частоты поглощения в ультрафиолетовом спектре (кислом и нейт- у ральном метаноле) 223 и 278 нм, и оо» ионном 242 и 292 нм.

5 12

Максимальные частоты поглощения в инфракрасном спектре (КВГ ): 2в99, 3,49, бв09в бв15в бв15в бв54 бв61в 6в94в

7,62„8,07;9,26 и 9,39 мкм.

Титруемую группу с величиной pKal

13,0 (начальный рН 7,91) в 66%-ном водном растворе диметилформамида.

Белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметидсульфоксиде, этипацетате и в водных растворах с рН выше 7,0; не растворимо в диэтидовом и петролейном эфирах.

Компонент C антибиотика, -30912, имеет".

Элементарный cocTBB %:

С 56,76

Н 7,88

И 10,61

О 25,09

Ы3 =-33 (С0$5t3снзон). (д.)," = - 119 (С 0,5; CH ОН) вбей

Максимальные частоты поглощения в ультрафиолетовом спектре (в кислом и нейтральном метаноле) 223 и 275 нм, в основном 240 и 290 BM.

Максимальные частоты поглощения в инфракрасном спектре (КЬ ) 2,98, 3,30, 3 43, 3,51, 6,01, 6,12, 8,47, 6,90, Титруемую группу с величиной рКа

13,08 (начальный рН 7,93) в 66%-ном водном растворе диметилформамида.

Белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, днметнлсудьфоксиде, этилапетате, и в водных растворах с рН выше.7,0; не растворимо в диэтиловом и петродейном эфиpGXo

Отдельные компоненты смеси антибиотиков А-30912 рааделяпот и идентифици« руют с помощью тонкосдойной хроматографии. Лучшим сорбентом авдяетса сйлик . гель; бензол-метанол (7: 3 по обьему) является лучшим растворителем.

Величины к g компонентов антибиотика

А-30912 с применением,тонкослойной хроматографии на силикагедв со смесью раствори елей бензод метанол (7:3) ис, биоме:р пяиу 1 микроорганивлвом QQfpgg сф"

Ыс пв приведены в табл. 3.

Таблипа 3

Компбнент комплекса

А 30912

0,35

0,45

0,54

0,59

0,5

0,625

0,078

0,07

Тис,hophston тспСа о рйчtes .Таблица 5

Компонент А антибиотика А-30912 против дерматофитов

Количество выделенных

Дерматофит

МИК (миг/диск) 1,25-0,039

> 1,25

0,0195

) 1,25

С 0,0О98

0,0195

0,0195

0 1,25«0, 156

О, 1 56-0,038

Компоненты А и Д антибиотика А-309121 обладают противогрибковой активностью.

Эту активность измеряют с помошью обычной диск-диффузионной методики. (тампоны 6 мм погружают в растворы, содер» жашие антибиотики, тампоны помешают íà 20

lvicbophvton entagriopbvtes

Тиспорйз1оп д аИю4Ю

Tr ichoph ton iпе гiпiпi

ТисЪорЬ 1оп quinckeanum

Tr*ichophgton ubrurn

Тисйор1п1оп ьсhoenceinii

Tricbopbyton 1е pestre

Тмс1 орЬ 1оп 1опьогons

М сгоьРо ium к рьеим агаровые пластины, засеянные испытуе мым организмом). В табл. 4 и 5 приведена минимальная ингибируюшая коппена рапия (МИК) на диск, при которой анти биотик А-30912 ингибирует перечислен, ные микроорганизмы.

Таблипа4

Продолжение табл. 5

Компонент А антибиотика А-30912 против дерматофитов

1,25-0,156

1,25 0,0098

1,25-0,0195

0,312

lA

М1сгоьройогп cclnis

М с оspoviurn сооМе

Ncrnnizzia incurvatcr

> 1,25

1,25

>1,25 0,156

0,156

Kcrpcrtinom>ces а еЯС о

Составитель Н. Бондаренко

Техред А. Алатырев Корректор Н

Редактор Т. Девятко

Заказ 4553/54 Тираж 715 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35,Раушская наб, д. 4/5 ниммюла ев ппп + пят вези г. Ужгоооп» vn. Проектная. 4

Р Ьа Ьмр%6М $r ghscr Сею бр1йег по1оphston gPoccosutn ео1р1с.Ицт ccrndidvm

Противогрибковое действие компонентов А и Д антибиотика А- 30912 в опытах Ю volvo показало на мышах, которых заражают СОнй1ЙО Qltt)rcQIt8l Три дозы антибиотика дают мышам через 0,4 и 24 ч. ® после заражения.

Зашита, обеспечиваемая антибиотиком, выражается в виде ЕЭ6 (эффективная доза, мг/кг), которая защищает 50% мышей, 35

Величины ЕВИНО для компонента А антибиотика А-30912 против Cotndicta (МСЫССЮв у мышей составляет 30 мгlкг (интрапери= тональное введение) и 50 мг/кг (подкож но). Величины Е3<© для компонента Д антибиотика А- 80912 против Cond)daaR

ЬССЮЬ у мышей составляет 33 мг/Kt (подкожно).

Не отмечается признаков острой токсичности при введении компонента А ан- 4 тиоиотика А-30912 интраперитонально или подкожно мышам при дозах 100 мг/кг дважды в день в течение 3 дней (всего

600 мг/кг). Не отмечается также признаков острой токсичности при введении интраперйтонально компонента А антибиотика A-30912 мышам дозами 200 мг/лй три раза в near. (всего 600 мг/кг). Не отмечается нризнаков острой - токсичности при введен ш компонента Д антибиотика А30912 подкожно мьппам три раза в день по 14 мг/кг (общаядоза 42 мг/кг).: формула изобретения

Способ получения антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью, о т л и ч а ю m и и с я g тем, что штамм Aspe i66us ГорЪВозов йМЮ, 8113 выращивают s аэробных условиях . на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением пелевого про дукта и разделением его на компоненты.