Патент 621724

Способ получения липазы

 

62l724

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Сопиалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 03.03.77 (21) 2459951/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.08.78. Бюллетень № 32 (45) Дата опубликования описания 02.08.78

M. Кл.е

С 12D 13/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

УДК 663.15 (088.8) (72) Авторы изобретения

Е. Л. Рубан, Г. А. Казаков, Г. Б. Ксаидопуло, А. А. Казак, T Ф. Куимова, Ю. М. Хохлова, О. Л. Рудаков, Л. Н. Сергеева и Л. П. Мурзина

Институт микробиологии АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПАЗЫ

Изобретение относится к технике получения липазы и может быть использовано в пищевой и медицинской промышленности, а также в животноводстве.

Известен способ получения липазы, предусматривающий культивирование ее продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и его очисткой (1).

Этот спосоо является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату. цродуцент липазы — гриб mucor liholiticus синтезирует липазу, активную в интервале рН 6,0 — 8,0, т. е. с охватом и щелочной области. Однако время культивирования этого продуцента, а также других известных продуцентов не менее 56 ч. Это приводит к тому, что в культуральной жидкости, примерно с конца вторых суток, идет накопление наряду с липазами и протеаз, которые снижают со временем липазную активность. Для уменьшения влияния протеаз в культуральную жидкость вводят ста25 билизаторы. Все это ведет к усложнению и удорожанию ферментационных процессов.

Целью изобретения является повышение активности фермента и увеличение диапазо- З0 па его действия при рН от 6 до 9 и температуре от 25 до 45 C.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения липазы в качестве продуцента используют гриб вида Qospora

fr a gr ans B erkh.

11ри этом из вида Oospora fragrans

Berkh используют штамм BI(MF-2024.

Кроме того, в качестве источника углерода используют соевую муку и сахарозу.

Гриб Oospora fragrans Berkh BKMF-2024 относится к группе несовершенных грибов, сапрофпт, выделен из зараженных семян подсолнечника. Колонии на сусло-агаре простирающиеся, телесного цвета. Гифы ветвистые, собраны в тяжи, частично приподнимающиеся и придающие колонии ветвистый вид. Гифы, субстратные и воздушные, с возрастом полностью распадаются на сидии 7 — 12;(15 — 50 мкм, удлиненно-цилиндрической формы, с тупо закругленными концами.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру Oospora fragrans Berkh

BKMF-2024 поддерживают на скошенном сусло-агаре при 4"С при пересевах через

4 — 6 месяцев, Для засева посевных колб используют

10-суточную культуру, Посевной материал

621724

Формула изобретения

Составитель А. Бражиикова

Редактор М. Дмитриева Техред А. Камышникова Корректор 3. Тарасова

Заказ 1700/!8 Изд. № 593 Тираж 554

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова. 2

3 выращивают в колбах объемом 3 л. Среду для посевного материала готовят на водопроводной воде.

Состав питательной среды, /о ..

Соевая мука 2,5

Сахароза 0,25

К НРО4 0,2 (NH4) 2$04 0,5

Мдко, 0,1

СаСОз 0,5

Оливковое масло 0,05 — 0,5

В трехлитровые колбы помещают по

500 мл указанной среды и вносят суспензию культуры гриба, приготовленную смывом со скошенного сусла-агара стерильной водой. Колбы с посевом помещают па круговые качалки (220 об/мин) и инкубируют при 28 С в течение 48 ч. Затем содержимое колб переносят через посевной люк в 100литровые ферментеры, содержащие 30 л среды того же состава. Ферментацию проводят при 28 - 1 С, рН 6,5 — 7,0 с перемешиванием при 360 об/мин и подачей воздуха на барботаж 1 — 1,5 объема на объем среды в минуту.

Наилучший выход липазы достигается при внесении инокулята в количестве 3—

4 /о от объема среды.

После культивирования гриба в ферментере в течение 24 — 48 ч, по достижении активности культуральной жидкости

600 мкМ олеиновой кислоты на 1 мл за 1 ч проводят слив культуральной жидкости и ее обработку по известной схеме выслаиванием сернокислым аммонием с последующим диализом в проточной воде по схеме с противотоком и дальнейшей лиофилизацией на сублимационной сушке.

Липазная активность продуцируемого фермента не менее 600 мкМ олеиновой кислоты на 1 мл за 1 ч после 24 — 48 ч культивирования в ферментере.

Использование высокопродуктивного 24—

48-часового продуцента липазы гриба Oospora fragrans Berkh на полусинтетической среде, содержащей в качестве источника углерода соевую муку и сахарозу, позволяет повысить удельный выход ферментного препарата липазы с единицы объема питательной среды по сравнению с бактериальными продуцентами липаз, а также получпть более широкий диапазон ее действия: рН от 6 до 9 и температура от 25 до 45 С.

Липаза с таким температурным диапазошзм и интервалом по pII представляет

5 большой интерес для медицины и животноводства. В медицине она может быть использована как лечебный препарат при нарушении функции поджелудочной железы.

В животноводстве опа может найти приме10 пение при откорме молодняка крупного рогатого скота на ранней стадии, когда у животных активность поджелудочной железы еще недостаточна. В обоих случаях нужна липаза широкого диапазона действия, так

15 как рН среды в желудочно-кишечном тракте меняется от кислых рН до щелочных.

Этим условиям работы соответствует предлагаемая липаза.

Кроме того, препараты с липазой дан20 ного диапазона могут быть использованы в кожевенной промышленности для обработки кож совместно с протеазными препаратами, а также в других областях народного хозяйства, особенно там, где по технологи25 ческим регламентам требуется широкий диапазон рН и температур.

Зр 1. Способ получения липазы, предусматривающий культивирование ее продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и его очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения активности фермента и увеличения диапазона его действия при рН от 6 до 9 и температуры от 25 до 45 С, в

4р качестве продуцента используют гриб вида

Oospora fragrans Berkh, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из вида Oospora fragrans Berkh используют штамм BKMF-2024.

45 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют соевую муку и сахарозу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

50 1. Патент Японии М 1938833, кл. 36 (2) С, опублик. 1975.