Способ получения ферментного препарата n-ацетил- глюкозаминидазы

Способ получения ферментного препарата n-ацетил- глюкозаминидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А-Н-И--ЕИЗОБРЕТЕН И я

Союз Советских

- 4 4-622282

Совналнстичесиих, Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к аьт. свид-ву —(51) М. Кл.

С 12 D 13/10 (22) Заявлено 07.12.76 (21) 2427603/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 23.12.81. Бюллетень № 47 (45) Дата опубликования описания 23.12.81.

Государственный комитет но делам изобретений и открытий (53) УДК 663.13 (088.8) (72) Авторы В. Ю. Авиженис, П. К. Томкявичюс, В. Д. Паюодис, изобретения П. Д. Валанчюс, Т. Ю. Падегимас, А-С. А. Глемжа и В. И. Лауцюс

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО

ПРЕПАРАТА N-АЦЕТИЛ-ГЛЮКОЗАМИНИДАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения разной степени очистки ферментов N-ацетил-глюкозаминидазы на основе выращивания бактерий

Bacillus subtilis G — 19.

Известны способы получения ферментного препарата Ж-ацетил-глюкоз ам инидазы путем глубинного культивирования микроорганизмов, например Streptomyces griseus, ATCC Xе 27800, который выращивают трое суток на качалках в колбах емкостью

2 л, содержащих 1 л питательной среды, состоящей из раствора 1 /О-ной коллойдной суспензии хитина и минеральных солей.

Эндо+Ж-ацетил-глюкозаминидазы выделяют из культуральной жидкости путем отделения биомассы через бумажный фильтр с последующим многостадийным осаждением ее из фильтра солями цинка и сернокислого аммония и очисткой на хроматографических колоннах с целлюлозой

М

Наиболее близким по технической сущности является способ получения препарата

Х-ацетил-глюкозаминидазы путем культивирования бактерии Bacillus subtilis глубинным способом в ферментере емкостью

40 л, наполненном 20 л питательной среды.

В качестве источника углерода используют

1 г/л глюкозы, 5 г/л азота-бактопелтон и (К2НРО4), минеральной соли: К НРО4—

0,4 г/л, МдЯО4 ° НаΠ— 0,05 г/л, NaCl—

0,1 г/л FeC1> . 6НаΠ— 0,017 г/л, (NH4) g HPO4 — 0,5 г/л. Ферментацию прогодят при 37 С с IIocTQBrIHQH подачей стерильного воздуха со скорость 20 л/мин.

Продолжительность ферментации 20 ч. Бактерии выделяют У-ацетил-глюкозаминидазу щ в культуральную жидкость, в основном в виде нерастворимой формы, адсорбированпой на клетках бактерий. После ферментации фермент и клетки бактерий собирают центрифугированием. V-ацетнл-глюкозами15 нидазу экстрагируют из осадка 0,1М трисбуфером (рН вЂ” 8,0), содержащим 3 — 4 M

NaCl. Потери на данной стадии составляют 62,5 /О. Далее фермент очищают при помощи ультрафильтрации, гель-фильтрации

20 и ионной хроматографии (2).

Однако существующий способ получения

N-ацетил-глюкозампнидазы является неперспективным потому, что для биосинтеза фермента требуются дорогостоящие и дефи25 цитные органические источники питательной среды. Фермент выделяется в культуральную жидкость в виде нерастворимой формы. Для его экстракции необходимы дополнительные технологические операции, 30 причем потери на данной стадии слишком

622282

3 велики. Процесс ферментации сравнительно продолжителен.

Цель изобретения — получение препарата Л -ацетил-глюкозаминидазы с повышенным выходом и его удешевлением.

Цель достигается тем, что в качестве продуцента бактерий из вида Bacillus subtilis используют штамм Bacillus subtilis

G-19, при этом культивирование осуществляют в течение 13 — 15 ч, а в качестве источника углерода и азота используют осахаренный крахмал, кукурузный экстракт и пивные дрожжи.

Штамм характеризуется следующими морфологическими и культурально-физиологическими признаками.

Морфологические признаки. Клетки имеют форму палочек размерами 1,7 — 3,3 мк на 0,5 — 0,6 мк. Палочки располагаются цепочками. Палочки подвижные с помощью перетриховых жгутиков, грамположительны. Культура образует споры размером

1,0 — 1,5 мк на 0,7 — 0,9 мк, форма спор эллипсоидальная, реже цилиндрическая.

Прорастают споры экваториально, путем разрыва мембраны вдоль экватора.

Культуральные признаки. На мясо-пептонном агаре после 24-часовой инкубации в термостате культура образует колонии диаметром 2 — 6 мм. Колонии сероватые, желтоватые, непрозрачные, иногда края гладкие, складчатые в центральной части поверхности.

Иногда культура твердо врастаст в агар. На ломтиках картофеля после 48 ч роста образует пленку бело-желтого цвета.

Пленка сморщена и окружена выступами, быстро образует субконечные споры, иногда центральные не деформирующиеся.

Пленка сухая в начале роста, становится далее вязкой. На поверхности мясо-псптонного бульона культура образует сморщивающуюся пленку бело-желтоватого цвста, мясо-псптонный бульон остается при этом прозрачным.

Физиологические признаки. Оптимальная температура роста 35 — 37 С при рН

6,2 — 6,6. Дыхание строго аэробное. Усваивает глюкозу, сахарозу и фруктозу с образованием кислоты без выделения газа. Нс усваивает лактозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, сорбит, маннит, дульцит и инозит. Гидролизует крахмал, разжижает желатину, пептонизирует молоко с образованием сгустка. Растет в среде с цитратами. Нптраты восстанавливает до нитритов.

На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол, Для выращивания бактерий Bacilllus

subtilis G-19 готовят питательную среду следующего состава, /о. .осахаренный крахмал 6,5; кукурузный экстракт 2,7; сухие пивные дрожжи 0,12; двухзамещенный фосфат аммония 0,5; калий сернокислый 0,33;

Способ получения ферментного препарата N-ацетил-глюкозаминидазы путем культивирования продуцирующих его бактерий

4 магний сернокислый 0,016; марганец сернокислый 0,1; кальций хлористый 0,013. Компоненты питательной среды для стерилизации делятся на три группы и стерилизуются раздельно. Питательную среду засеивают посевным материалом Bacillus subtilis

G-19, при 45 С и рН вЂ” 6,6. В начале ферментации рН снижается до 6,2, после чего автоматически поддерживается рН при по10 даче 20 "/о-ной аммиачной воды в пределах

6,4 — 6,6. Продолжительность ферментации

13 — 15 ч. Активность N-ацетил-глюкозаминидазы определяется по вискозиметрическому методу.

rid Испытание изобретения проведено в лабораторных и полупроизводственных условиях.

Культивирование проводят глубинным способом в ферментере емкостью 1500 л, 20 при коэффициенте заполнения 50 /о, т. е. в

750 л питательной среды. В ферментер передают 100 л осахаренного крахмала с

40 — 45 Б, 225 л раствора солей содержащего ISO 2,48 кг; MgSO4 0,127 кг;

Мп804 0,75 кг; NaCI 0,248 кг; СаС1 0,1 кг.

Раствор стерилизуют 30 мин при 130 С.

Для приготовления раствора азотистых веществ в чан заливают 220 л воды и добавляют 20 кг 50О/о-ного кукурузного экстЗ0 ракта, 0,9 кг сухих пивных дрожжей, 3 л подсолнечного масла. Раствор передают в сателит и стерилизуют 45 мин при 130 С, В другом сателите стсрилизуют раствор двухзамещенного фосфата (55 л воды и

3,75 кг (КН4) HPO4) при 130 С в течение

30 мип, После стерилизации компоненты охлаждают до 45 С и передают в ферментер, доводят рН среды аммиачной водой до 6,6.

40 После того засеивают посевным материалом Bacillus subtilis G-19, затем включают мешалку и подают стериальный воздух со скоростью 0,4 м /мин.

Спустя 4 — 6 ч температура среды пони45 жается до 37 С и далее поддерживается постоянной во время ферментации рН среды в начале ферментации понижается до

6,2, после чего автоматически поддерживастс я в и р ел ел а х 6,4- — 6,6.

Биосинтез У-ацетил-глюкозаминидазы начинается с 8 ч ферментации, а особенно интенсивно идет в конце ферментации.

Активность N-ацетил-глюкозаминидазы в конце ферментации достигает 24 ед/мл.

55 При производстве ферменгного препарата Л"-ацетил-глюкозаминидазы в объеме

55 т в год в системе Главмикробиопрома годовой экономический эффект составляет

109,5 тыс. руб.

Формула изобретения