Способ получения агрегата микробных клеток

Способ получения агрегата микробных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н. ."И.Е.

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социали стим вских

Реслублик

Майа. и.76 1

К ПАТЕНТУ (61)Дополнительный к патенту (22) Заявлено 22.12.75 (21) 2301289/28-13 (23) Приоритет - (32) 23.12.74 (31} 535615 (ЗЗ) США (43) Опубликовано 05.10.78pnллетeнb )4 37 (45) Дата опубликования описания11.08.78

Д (51) М. Кл, С 12 g 13/10

Государстеенньб немнтет

Совета Мннестреа СССР еа делам нзебретенне н еткрмтнй (53} УДК 577.1. ), .07(088.8) Иностранец

Маргарет Эстер Лонг (США) (72} Автор изобретения

Иностранная фирма

" P. Дж. Рейнольдс Тобакко Компани (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГРЕГАТА

МИКРОБНЫХ КЛЕТОК

Изобретение касается анзиматического процесса с применением иммобилизированных микробных клеток, а именно способа получения агрегата микробных клеток.

Микробные клетки, имеющие связанные 5 с ними активные энэимы, флоккулируются в присутствии некоторых металлических соединений и образуют стабильные, содер жащие клетки, агрегаты. Согласно известному способу получении указанных агре- 10 гатов осуществляют культивирование микроорганизмов в жидкой питательной среде, вводят флоккулянт, в качестве которого используют, например, Примафлок, С-7

А-10, отделяют полученные агрегаты от 15 культуральной жидкости, осуществляют экструзию флоккулированных клеток, а затем их сушат 1 .

Однако полученные данным способом агрегаты микробных клеток недостаточно Ю твердые .и стойкие. С течением времени имеет место потеря их энаиматической активности.

С целью увеличения твердости и стабильности агрегатов клеток согласно пред-2б лагаемому способу перед введением флокс. кулянта, в культуральную жидкость добавляют окись или гидроокнсь ипи фосфат или сульфат магния или кальция или железа или марганца.

При атом для культивирования из микроорганизмов используют микроорганизмы

pwa Д & оЬа с te r

Таким образом в описываемом способе предусмотрены приемы, обеспечивающие стабильность агрегатов флоккулированных. клеток, в связи с чем они проявляют большую стойкость против уплотнения в процессе культивирования.

Улучшение стабильности агрегатов клеток способствует также значительному увеличению скорости течения растворов субстрата через их слой, что в свою очередь делает возможным вести переработку растворов сравнительно высокой вязкости

Пример l. В результате культивирования микробиологической культуры

Агт.Ит оЬас1ет К Ь 3728„ на питательной среде получают культурапьную

627761 жидкость, от которой отбирают порцию в 19 и и вводят в нее 716 и 1%-ного раствора Примафпок С-7 (рН которого предварительно доводят от 5), затем вводят 7,7 и 1%-ного раствора. Примафпок

А-10 (рН которого предварительно доведен до 7) °

Примафпок С-7 и А-10 являются катионным и анионным фпоккупянтами, поставленными фирмой Ром и Хаас Филадельфия.

После добавления фпоккупянтов раствор перемешивают 5 минут и фпоккупированные клетки отделяют фильтрованием. Влажные агрегаты фпоккупированных клеток экструдируют и экструдат вйсушивают при 55 С в шкафу с принудительной тягой в течение 18

15 часов. Высушенный материал:размапывают и просеивают, отбирают частицы крупностью

16 — 20 мкм. Определяют активность изомеразы глюкозы этих частиц. Она составила 62,7 миппиединиц/грамм. Берут вто20 рую порцию купьтурапьной жидкости и объемом 1 л перемешивают с 60 г окиси магния до увеличения рН от 5,7 до 8,5.

Дальнейшую обработку этой смеси ведут

35 аналогично описанному выше.

Отдепяют агрегаты крупностью 1626 меш и определяют активность изомеразы их. Она равна 52,1 миппиединиц-грамм, Дпя проверки твердости агрегатов клеток

30 и определения эффективности описываемого метода применяют прибор дпя измерения твердости и сопротивления сжатию полученных частиц.

Подлежащие испытанию агрегаты поме35 шают между пластинами прибора, одна иэ которых выполнена с возможностью пер мещения с заданной скоростью в направлении неподвижной пластины. Этим прибором можно измерить усилие, необходимое

40 дпя сжатия агрегатов до заданной толщины, например до 0,381 мм, т. е. подвижная пластина не доходит до неподвижной на 0,38 мм.

Было установлено, что скорости тече45 ния растворов субстрата через слой фпок купированных клеток становятся более стабильными и не уменьшаются по мере увеличения сопротивления сжатию агрегатов фпоккупированных клеток.

Дпя определения твердости высушенных агрегатов фпоккупированных клеток (размером 16-29 меш) их погружают в воду при комнатной температуре на 4 часа (дпя набухания). Затем воду заменяют рав55 ным объемом 2М раствора глюкозы с рН 8,0.

Дпя этого частицы из воды переносят в этот раствор и выдерживают в нем в течение ночи, имитируя тем самым усповия) в которых агрегаты, находятся при изомеризации глюкозы. Затем иэ числа погруженных в раствор глюкозы агрегатов берут 10 и промокатепьной бумагой удаляют с них раствор, поспе чего помещают и центре пластин (между ними), чтобы агрегаты не соприкасались между собой, и опредепяют величину сопротивления сжатию агрегатов.

При этом получают, что на сжатие агрегатов клеток, полученных по предлагаемому способу (с добавлением окиси магния) требуется усилие в 9,5 кг, а на сжатие контрольных — 3,3 кг.

Дпя определения скоростей течения субстрата через слой агрегатов фпоккупированных частиц бьша проведена их оценка в условиях непрерывной работы.

Для этого 75 r высушенных частиц размером 16-20 меш, полученных при осуществлении предлагаемого способа и контрольным приемом, было погружено в воду на некоторое время дпя набухания.

Затем материал бып промыт 8 и 0,004М раствора хлористого магния, содержащего

0,1 М раствор бикарбоната натрия в качестве буфера. Промытые частицы в каждом случае загружали в снабженные рубашкой колонки диаметром 1 дюйм, нагрева о мые до 60 С. Через колонки самотеком пропускали 50%-ный по весу раствор глюкозы, и. определяли скорости течения его.

Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что фпоккупированные клетки, содержащие добавленную окись магния, обнаруживают более замедленное уменьшение скорости течения раствора глюкозы, чем "необработанные (контропьные).

Было найдено, что кроме окиси мат ния эффективными дпя получения агрегатов фпоккупированных клеток 4нthrobaeter с увеличенной твердостью является ряд других соединений .(по определению прибором Инстрон). В табл. 2 показаны резупьтаты, полученные с различными добавками при осуществлении способа Методики. Некоторые соединения, например углекислый магний, хпористый магний и углекислый кальций, являются неэффективными в случае их использования,при осуществлении описываемого способа.

Пример 2. Дпя оценки эффективности настоящего изобретения способ осуществпяют с применением другого микроорганизма, образующего гпюкоизомераэу, В этом случае среду (250 мп), содержащую 1% пептона, 0,25 % дрожжевого экстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,05% семиводного сульфата» марганца, 0,5% хлористого натрия, 2% «сипозы и 0,003М хлористого кобальта засеивают И1 йфО1П С6&

627761

Таблица 1

Сравнение скоростей течения раствора глюкозы через слой флоккулнрованных клеток А» 1И гоЬас1е

Клетки, флоккулированные Примафлоком С7 и -10 75 r частиц, 16-20 меш.

Клетки, флоккулирэваниые

Примафлоком С-7 и А-10, 75 г частиц, 16-20 меш. содержат окись магния

349,9

21,9

6,0

44

21,0

68lt76

aRlug ATCC 21132. Культивирование ве1 дут в однолитровой колбе на вращаюшемся столе при +"С в течение 48 часов и затем ее используют для посева в 10литровый ферментатор, аэрнруемый со скоростью 2, 5 литра воздуха в минуту и перемешиваемьш со скорость 200 об/мин.

Флоккулирование получившейся мвцнлальной суспвнзии, равно как н оценку флоккулн1 рованных агрегатов, производят как описано в примере 1.

Пример 3. МикроорганизмЪас Иц ;

COdgllEQhs засевают на среду, содержащую 1% протеазы пентона, 1% дрожжевого экстракта, 0,8% КН РОАи 2% лактозы

15 (стерилизованной).рН среды 6,0,инкубацию проводят при 45 С в течение 48 часов на вращающемся столе. По окончании инкубации добавляют толуол (0,5% от объема) и смесь перемешивают 30 минут. Флокку20 пяшпо и извлечение аграгатов флоккулированных клеток осуществляют по методике описанной выше для ЬИ МРObacler> за исключением того, что добавляют

4,6 г/л Примафлок С-7 в виде 1,5%-но25 го раствора и затем 1,5 г/л Примафлок

A-10 в виде 1%-ного водного раствора.

Оценку флоккулированных агрегатов (частицы 16-20 меш) производят обычным образом, за исключением того, что чаотицы погружают в 2%-ный раствор лактозы, имеющей 60 С, а не.2М раствор глюкозы. Твердость по Инстрону равна

4,6 кг. Испытание активности лактозы этих частиц дало 38,5 единиц на грамм сухого веса

Метод флоккуляции для Ва с И ив соаДц0а NG повторяют за исключением того, что окись магния 2,5 г/л добавляют перед флоккуляцией.. Полученные частицы 12-20 меш имеют твердость по Инстрону 6,0 кг и активность лактозы 26,5 единиц

На выбор данной добавки для применвния в настояюпем изобретении влияют несколько факторов, включая стабильность энзима, оптимальный для энзиматического превращения диапазон рН и реакцию микробных клеток на локулянты в присутствнк выбранной добавки . Например щелочная добавка, такая как окись кальция, не будет пригодна для применения с энзимом, имеющим максимальную активность при рН-4. Конечный выбор добавки зависит от условий фактической работы так, что необходимы некоторыв опыты для: определения оптимального состава. Определения этого опти« мального состава наиболее удобно делать тутем выбора вначале флоккулируюшего агента или агентов, а затем оптимального количества их. Эффективность различных добавок при различных уровнях оценивают обычными методамн.

Количество добавки, требуемое для полученяя . желаемой твердости, может и меняться от 1 до 12% по весу влажных флоккулируемых клеток. Предпочтительным является уровень от 2 до 6% по весу влажных клеток.

627761

8

Т а блиц а 2

Флоккуляция клеток Arthur pbactey КРЯ1, В-3728 в присутствии различных добавок с применением флоккулируюпцих агентов Примафлок С7 и А-10

Контроль (беэ добавки) 3.3

62,7

Окись магния

Гидроокись магния

Кислый фосфат магния

Окись капьция

21,5

10,5

43,1

7>4

45,4

7,5

37,2

Гидроокись кальция

8,0

35,0

Трифосфат кальция

Сульфат кальция

Окись марганца

Окись железа

Углекислый магний

Хлористый . магний

Углекислый кальций

54,6

6,0

53 5

40,4

46,5

2,9

594

41,3

49,6

Т аблицаЗ

Флоккуляшия бЬ ер1а кусеЭ ОИИ4Э АЧТ:С 21132 -в присутствии раэличиых флоккулирующих агентов и добавок

Примафлок С-7 (13,5 г/л в виде 2,7%-ного водного раствора), затем Прима

@ox А- 10 (4,35r в виде 2,9%-ного водного раствора) Контроль (беэ добавки) 22,0

12,4

Примафлок С-7 (13,5г/л

1 в энде 2,7%-ного водного раствора), затем Примафлок А-10 (4,35 г/л в виде 2,0%-ного водного

PscTBOp&

Окись магния

40,0

5,85

627761

Продолжение табл. 3

Контроль (без добавки) 12,0

6,5

Окись магния

34,0

1,8

Контроль (беэ добавки) 3,2

10,0, Гидроокись кальция

5,9

1) Катфлок- полиаллилдиметил, аммоний хлорид - катнонный электролит.

2) Делфлок 763-катионный полнэлектролит полиамидно эпихлоргндрированного типа.

Формула изобрэтения

Источники .информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент. СССР Ж 544380, ;кл. С 07 С(7/02, 1973.

Составитель И. Андреева

Редактор О. Иванова Техред О, Андрейко Корректор А Власенко

Заказ 5494/5 Тираж 568 Подписное

Ш4ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открыгий

113035, Москва, Ж-53, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Катфлок ) (2,5 мл/л без предварительного разбавления)

Катфлок (2,5 мл/л без предварительного разбавления)

Йелфлок 7631 (2,5 мл/л

k без предварительного разбавления)

Дэлфлок 763, (2э5 мл/л и беэ предварительного разбавления) 1. Способ получения агрегата микроЬных клеток, предусматриваюкий культиви- ЗО рование микроорганизмов, в жидкой питательной среде, введение флоккулянта в культуральную жидкость для образования агрегатов клеток, отделение полученных агрегатов от культуральной жидкости, 3 экструзию флоккулированных клеток с пооледуюшей сушкой, о т л и ч а ю m и йс я тем, что, с целью увеличения твердости и стабильности агрегатов клеток, пе40 ред введением флоккулянта в культуральную жидкость добавляют окись или гидроокись или фосфат илн сульфат магния или кальция или железа илн марганца.

2. Способ,по. и. 1, о т л и ч а юm и и с я тем, что из микроорганизмов культивируют микроорганизм рода Д tb гоЬас1е .