Способ получения цитидин-5"-дифосфатхолина

Способ получения цитидин-5"-дифосфатхолина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ С(?ИЛЕТЕЛЬСТВУ л т,, р.-.=, P;"„т (61) Лополнительное к авт, свид-ву (22) 2605.77 (21) 2489163/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23» Приоритет(43) Опубликовано 0511,78.Бюллетень № 41 (51) Ы. Кл.

С 12 D 13/00

Государственный комитет

Совети Министров СССР оо велим и.и16ретений и открытий (5З) УЛК 663. 18 (088. 8) (45» Лата опубликования описания 251178 (72) Авторы изобретения

В.К.Кайсала, С.Э.Ансберга и В.П.Каула (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТИДИН-5 -ДИФОСФАТХОЛИНА

Изобретение относится к технике получения биологически активных веществ, а именно цитидин-5 -дифосфат( холина, используемого в качестве посредника в биосинтеэе фосфолипидов в микробиологической промышленности, а также в качестве эффективного лекарства при лечении болезней голов-, ного мозга в медицине.

Известен способ получения цитидин-10

Г

-5 -дифосфатхолина путем биологического фосфорилирования фосфорилирующей смеси, состоящей из биомассы микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, производного холина, источника сахара, сульфата магния, фосфатного буфера и воды при рН равном 7,0 и температуре 30 С с последующей очисткой целевого продукта (1) .

Указанный способ является наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату.

Основным недостатком известного способа является низкий выход цитидин-5 -дифосфатхолина (11ДФ-холина), равный всего лишь 50Ъ, вследствие применения B среде биосинтеза ингибитора-глюкозы, которая ингибирует активные центры ферментного комплекса.

Целью изобретения является повышение выхода цитидин-5 -дифосфатхолис на.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения цитидин-5 -дифосфатхолина перед фосфорилированием смеси биомассу микроорганизмов выдерживают в фосфатном буфере при -20 С в течение 2-4 дней, при этом в состав фосфорилирующей смеси дополнительно вводят экстракт зеленых

/ водорослей и аденозин-5 -трифосфорную кислоту, а в качестве источника сахара используют 1, 6-днфосфатфруктозу.

Экстракт зеленых водорослей вводят в количестве 0,05-0,1 мг/мл. Аденоэин-5-трифосфорную кислоту и 1,6-дифос/ фатфруктоэу вводят соответственно в количествах 7-8 мг/мл и 10-30 мг/мл.

Способ осуществляют следующим образом.

Биомассу микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, выдерживают в фосфатном буфере при -20оС в течение

2-4 дней для освобождения и активирования. ферментных комплексов, что улучшает отщепление ферментов от балластных веществ (нуклеиновых кислот и полисахаридов) .

1528

10

Формула изобретения

Составитель A.Áðàæíèêîâà

Редактор Н.Самедова Техред М.Борисова Корректор A.Êðàâ÷åíêî

Заказ 6287/26 Тираж 526 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 63

В среду биосинтеза, содержащую выдержанную в фосфатном буфере и оттаявшую биомассу микроорганизмов, произ водный холина, источник сахара, сульфат магния, фосфатный буфер и вОду, дополнительно вводят экстракт зеленых водорослей 0,05-0 1 мг/мл и аденозин-5-трифосфорную кислоту 7-:8мг/мл

В качестве источника сахара используют 1,6-дифосфатфруктозу 1030 мг/мл.

Фосфорилирование фосфорилирующей смеси проводят при рН-7,0 и 30 С с последующей очисткой целевого продукта.

В качестве биомассы микроорганизмов используют пивные дрожжи 5accbavomqces cer ev s ae.

Экстракт зеленых водорослей используют в качестве источника фосфорилирующих ферментов, необходимых для

I превращения цитидин-5-монофосфата в

I цитидин-5-дифосфорную кислоту, а аденозин-5-трифосфорную кислоту — в качестве источника макроэнергии и в виде макрознергетических фосфатных связей †. затравкой — началом цепи превращений, необходимых для синтеза ! цитидин-5-дифосфатхолина.

Введение в смесь 1,6-дифосфатфруктозы является необходимым для образования цитидин-5-дифосфатхолина в ферментных процессах, так как это вещество является конечной формой превращения сахаров в гликолитическом цикле.

Пример 1. Предварительно высушенные пивные дрожжи 5acBtavamgcee

cevevieiae 100 мг (влага 30%) суспендируют в 10 мл фосфатного буфера калия и выдерживают 2 дня при -20 С.

Суспензию оттаивают при комнатной температуре и добавляют, мг/мл:

ЦМФ вЂ” Ма < — 7,38; холин-24; 1,б-дифосфатфруктоза — 20; М 604 2НО 2,96;

АТФ вЂ” 4; и 3 мл экстракта зеленых водорослей. Общий объем реакционной смеси дистиллированной водой доводят до 30 мл и культивируют 4 ч при

+30 С.

«

Цитидин-5 -дифосфатхолин очищают на ионообменной смоле известным методом. Выход составляет 80%.

П р и м e p 2. Подготовку биомассы дрожжей проводят согласно примеру 1. Добавляют 10 мг/мл 1,6-дифосфатфруктозы.

Выход составляет 80%.

Добавляют 30 мг/мл 1,6-ДФФ.

Выход составляет 79%.

Пример 3. Подготовку биомас сы дрожжей проводят согласно примеру 1. В смесь биосинтеза добавляют

6 мг/мл ATC. Выход составляет 80%.

В. смесь биосинтеза добавляют

8 мг/мл АТФ. Выход составляет 82%.

Пример 4. Биомассу дрожжей выдерживают при -20 С 4 дня. Состав среды, температура и длительность биосинтеза, как в примере 1. Выход составляет 80%.

Технико-экономический эффект предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в повышении выI хода целевого продукта цитидин-5-дифосфатхолина на 30%.

1. Способ получения цитидин-5-дифосфатхолина путем биологического фосфорилирования фосфорилирующей смеси, состоящей из биомассы микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, производного холина, источника сахара, сульфата магния, фосфатного буфера и воды при рН равном 7,0 и температуре 30еС с последующей очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю .щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода, перед фосфорилированием смеси биомассу микроорганизмов выдерживают в фосфатном буфере при -200С в течение 2-4 дней, при этом в состав фосфорилирующей смеси дополнительно вводят экстракт зеленых водорослей и

l аденозин-5-трифосфорную кислоту, а в качестве источника сахара используют

1,б-дифосфатфруктозу.

2. Способ по п.l, о т л и ч а ю шийся тем, что экстракт зеленых водорослей. вводят в количестве 0,050,1 мг/мл.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю—

1 шийся тем, что аденозин-5-трифосфорную кислоту и 1,6-дифосфатфруктозу вводят соответственно в количествах

7-8 мг/мл и 10-30 мг/мл.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США Ф 3684652,кл.195-28, 1972.