Способ получения ферментных препаратов каталазы и глюкозооксидазы

Способ получения ферментных препаратов каталазы и глюкозооксидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

< 631530

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Саюз Соаетснии

Сецнвнистичесник

Республик (61) дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 1406.77 (2%) 2496287/28-13 с присоединением заявки И (23) Приоритет (43) Опубликовано 0Ы178.Бюллетень № 41

{45) Дата опубликования описания 2511.78 (53) M. Кл.

С 12 D 13/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытн и (53) УЛК 663, 11.576. .8093,1(088.8) (72) Авторы изобретения

М.Ф.Гулый, P.Ã.Äåãòÿðü, Н.Л.Долгий, E.A.Íèêoëüñêàÿ, Н,A.ßñèê÷óê, Т.Ф.Сай, Н.Г.Надеждина и Л.М.Балагурак

Pl) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

КАТАЛАЗЫ И ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ

Изобретение относится к технологии получения ферментных препаратов, в частности каталазы и глюкозооксидаэы, из микробиологического сырья и может быть использовано в ферментной промышленности.

Указанные Ферменты находят широкое применение, так фермент глюкоэооксидазы находит широкое применение в ряде отраслей пищевой промышленности в ка- >0 честве антиоксиданта и для удаления глюкозы, в медицинской практике для высокочувствительного и специфического метода определения глюкозы, а также для исследовательских работ по ферментам.

В отечественной практике в качестве продуцента глюкозооксидазы используется микроскопический гриб РептстЯРтитп мтМсе Р dopK. ет. ВiRai, при глубинном выращивании которого культуральная жидкость содержит глюкоэооксидазу и каталаэу.

В настоящее время технология производства очищенных ферментных препаратов глюкозооксидазы предусматривает использование в качестве сырья культуральной жидкости.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту явля\ ется способ получения ферментных препаратов каталазы и глюкоэооксидазы из плесневого .гриба Penici 2Eium чКасе Pido@R. et ViEai,предусматривающий последовательную раздельную нх адсорбцию на каолине в кислой среде с по следующим элюированием ферментов фосфатным буфером, осаждением органическим растворителем, очисткой и сушкой 11 .

Препарат, полученный по данному способу, имеет глюкозооксидазную активность,равную 150-200 Е/мг.

Однако при производстве глюкозооксидазы иэ гриба мицелий гриба является отходом производства.

В то же время установлено, что биомасса гриба Реа с Итипт vitals содержит значительное количество глюкозооксидазы.

Целью изобретения является повышение эффективности процесса.

Поставленная цель достигается тем, что перед адсорбцией ферментов на каолине мицелий гриба отделяют от культуральной жидкости, измельчают и экстрагируют из него ферменты трех-четырехкратным объемом воды, а адсорбцию каталазы и глюкоэооксидазы проводят из экстракта соответственно при

631530. ления основного количества солей и остатков спирта. Диализат содержит

100Ъ фермента, находящегося в элюате, и 88Ъ фермента по отношению к его содержанию в исходном экстракте.Огдиализированный раствор высушивают в вакууме при условиях, определенных для фермента, выделяемого из культуральной жидкости.

Очищенные препараты глюкозооксидазы представляют собой порошки желто0 го цвета, легко растворимые в воде.

По своей активности, специфичности и другим качествам они соответствуют препаратам, выделенным из культуральной жидкости продуцента.

15 Внедрение предлагаемого способа на Львовском заводе бактерийных препаратов, позволит получать очищенные препараты, в частности глюкозооксидазы из мицелия грибаРеа с И аж vita8e, являющегося отходом производства микроцида и глюкозооксидазы. При этом выход продукта составляет 4060Ъ продукта, выделяемого из культуральной жидкости.

Предлагаемый экономический эффект по Львовскому заводу бактерийных препаратов, выпускающему в год 2 кг глюкозооксидазы, составит порядка 30 тыс. руб. в год.

Формула изобретения

1. Способ получении ферментных препаратов каталазы и глюкозооксидазы из плесневого гриба Реп с И ип ч tate Vidop8. et 5jlcx< включающей последовательную раздельную их адсорбцию на каолине в кислой среде с .последующим элюированием ферментов фосфатным буфером осаждением органическим растворителем, очисткой и сушкой, отличающийся

40 тем, что, с целью повышения эффективности процесса, перед адсорбцией Ферментов на каолине мицелий гриба отделяют от культуральной жидкости, измельчают и экстрагируют изнего ферменты трех-четырехкратным объемом воды, а адсорбцию каталазы и глюкозо.оксидазы проводят из экстракта соответственно при рН 4,0-4,3 и 3,4-3,5.

2. Способ по п.1, о т л и ч а в шийся тем, что элюирование глюкозооксидазы осуществляют трех-четырехкратным объемом 0,3 М фосфатного буфера при рИ равном 6,28.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что очистку водного раствора глюкозооксидазы проводят диализом.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР

9 204962, кл. С 12 H 13/10, 1966. рН 4,0-4,3 и 3,4-3,5. При этом элюирование глюкозооксидазы осуществляют трех-четырехкратным объемом 0,3 М фосфатного буфера при рН равном.6,28, а очистку водного раствора глюкозооксидазы проводят диализом.

Пример. 0,5 кг мицелия гриба

9enici80iurn -vita Pe отфильтровывают от культуральной жидкости, измельчают его на гомогенизаторе и при перемешивании экстрагируют ферменты двумя литрами воды в течение 1

30 мин ° Экстракт отделяют от измельченного мицелия центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин, рН экстракта равно 4,3 1 мл такого экстракта содержит 63Е каталазы и 47Е глюкозооксидазы.

Затем из экстракта выделяют каталазу. Для этого к экстракту прибавляют 20 r каолина и 15 мин перемешивают. При таких условиях 1 г каолина сорбирует 6220Е каталаэы. Таким образом иэ раствора адсорбируется около

99Ъ каталазы, Осадок адсорбента с каталазой отделяют центрифугированием.

После этого к 2 л центрифугата, содержащему только глюкозооксидазу (98000K), при перемешивании прибавляют 2,5 мл 20Ъ серной кислоты и доводят рН раствора до величины 3,4.

К кислому раствору прибавляют 55 г каолина. Смесь перемешивают 15 минут, при этом адсорбируется 98,6Ъ Фермента.

1 r каолина в таких условиях адсорбирует 1800Е глюкозооксидазы. Затем, осадок адсорбента с ферментом отделя"ют центрифугированием.

Адсорбированную на каолине глюкоэооксидазу при интенсивном перемеши" ванин в течение 40 мин элюируют

165 мл 0,3 М фосфатным буфером с

pH=6,28. Элюат отделяют центрифуги рованием: B течение 20 мин при

3000 об/мин. Адсорбент промывают

82 мл 0,1 М Фосфатного буфера рН6,28 и отделяют осадок центрифугированием в течение 20 мин при 3000 об/мин.

Элюат и промывной раствор соединяют, полученный раствор содержит около

89Ъ сорбированного фермента.

Раствор охлаждают до +2 С и осаждают фермент 375 мл этилового спирта, охлажденного ранее до -15 C.

Осадок фермента отделяют центрифугированием при +5 С в течение 20 мин.

Затем фермент растворяют в 25 мл хо лодной воды и центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин для удаления балластных веществ.

Раствор фермента подвергают диализу через :;еллофан в течение 2-4 ч против дистиллированной воды для удаЦИИИПИ Заказ 6287/26 Тираж 526 Подписное

Филиал атент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4