Способ получения гиалуронидазы

Способ получения гиалуронидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

«"Й

Союз Советских

Социалистических

Республик

О П И С А" Н Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

632703

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Доп0.1Hнтелbное к авт. свиа-ву— (22) Заявлено 11.04.77 (21) 2471215/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет(43) Опубликовано15.11.78.Ьвллетень У,. 42 (45) Дата опубликования от1исання 25.11.78 (51) М. Кл.

С 07 Cj 7/02

Гаоударственный комитет

Соввтв Министров СССР по делам изооретенкй н открытий (53) УДК 577.15, .07 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. Х. Кирсе, Г. Н. Струкова, А. A. Марнауза и 3. Я. Балгбарздис (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ

Изобретение относится к способу получения ферментных препаратов, в частности к способу получения гиалуронидазы (КФ 3,2. 1.35)-фермента, регулируюшего кагаболизм гликоэамингликанов в живом организме. Этот фермент находит широкое применение в животноводстве, рыбном хозяйстве, кожевенно-меховой промышленности, а также в медицине и в лабораторной практике.

Гиалуронидаэа содержится во многих тканях и жидкостях животных. Наиболее богатыми источниками гиалуронидазы животного происхождения являются тестикулы и сперма (1) . Известно несколько способов выделения гиалуронидазы иэ теотикул крупного рогатого скота (1) . Все они основаны на том, что эксгракцию ткани проводят в кислой среде (разбавленная уксусная кислота или ее смесь с разбавленной соляной кислотой) с последуюшим фракционированием сульфатом аммония или органическими растворителями и хроматографией.

Известен, в частности, способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого mora (2l . Способ заключается в следующем: все операции ведут при о

О - 5 С. Замороженные сухим льдом ткани тесгикул гомогенизируюг в равном количестве воды. К суспензии добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 4,0. Ооо тавляют при температуре 4 — 5 С на 15ч.

11ентрифугнруют. Осадок реэкстрагируют водой. Недосадочные фракции обьединяют.

Фильтруют. Иоводят рН до 4,5. Йобавляюг сульфат аммония до 10-12%-ного насыщения. Осадок удаляют ценгрифугированием. Иалее добавляют сульфат аммония до 30-40%ного насыщения. Белок, солержаший ферменгагивную активность, с бираюг ценгрифугированием и диализуют против холодной проточной воды в течение 27 ч. Огдиализованный раствор лиофилиэую г.

Выход 2,5 r иэ 1 кг исходного магериала. Активность 54,5 МЕ/мг.

Однако эгог способ получения гиалуронидаэы имеет ряд недостатков. Так, фер632703 мент получают с низким выходом (2,5 r" из 1 кг сырья), так как в качестве исходного сырья используют семенники крупного рогатого скота, из которых получают малоконцентрированные экстракты; причем имеются потери фермента в процессе экстракции, где при рН 4,0 часть фермента осаждаетса вместе с баластными веществами. Часть фермента теряется при осаждении сульфатом аммония 10-12%-ного 16 насыщения. Часть активности теряется в процессе фильтрования.

Кроме того, получен ны и пр е пар а т фермента характеризуется сравнительно низ кой активностью (54,5 МЕ/мг). 13

Белью изобретения является повышение активности и выхода целевого продукта.

Укаэанная цель достигается за счет того, что в качестве исходного . сырья исполу зуют сперму крупного рогатого скота, заб-Я ракованную для искусственного осеменения, акстракцию проводят не кислым буфером, а раствором хлористого натрия при рН

5,8 - 6,3, поскольку, начиная с рН 5„6 и ниже, наблюдаетса выпадение осадка, в 2$ который вовлекается часть фермента, что приводит к значительной его потере. Фракционирование сульфатом аммония проводят в два этапа, причем 1-ое фракционирование ведут 60-65%-ным насыщением суль- 39 фата аммония, 2-ое фракционирование проводят на стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммония, llo

38-45%-ного насыщения и 65-70%-ного насыщения и конечный продукт выделяют И известным способом.

Из спермы можно получить концентрированные экстракты без дополнительной обработки сырья. Зто позволяет выделить фермент с минимальными потерями актив- Ю ности

На первом этапе осаждения 60-65%-но. го насыщения сульфатом аммония получают фракцию, содержащую практически весь фермент,.содержащийся в экстракте и низкомолекуларные примеси. Зта операция позволяет сохранить всю активность фермента беэ потерь. При помощи диализа освобождаются от ионов сульфата и аммония и части низкомолекулярных примесей.

После диализа - насыщением диализата до

38-459 сульфатом аммония-полностью отделают все баластные белки. Ловедением до насыщения сульфата аммониадо 65-70% осаждают гиалуронидазу.

53

Фракционирование в три этапа позволяег выделить весь фермент с высоким выходом и активностью.

Согласно изобретению описывается способ получения гиалуронидаэы с высоким выходом и удельной активностью посредством экстракции раствором хлористого натрия с рН 5,8-6,3 спермы крупного рогатого скота, забракованной для искусственного осеменения, затем экстракт подвергают фракционированию сульфатом аммония, причем 1-ое фракционирование проводят

60-65 /-ным насыщением сульфата аммония, 2-ое фракционирование проводят на стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммония до 38-45/ного насыщения и 65-70/-ного насыщения и конечный продукт выделяют известным способом

Предпочтительно процесс выделения про- водят следующим образом:

Сперму оттаивают, разбавляют в пять раз 0,15 М раствором хлористого натрия в дистиллированной воде; рН смеси 5,86.3. Смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при температуре 4-5 С, центрифугируют. добавляют сульфат аммония до 60-65 ного насыщения. Оставляют о при температуре 4-5 С в течение 4 ч.

Бентрифугируют, Осадок растворяют в дистиллированной воде, диализуют в течение

24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в диализатецентрифугируют. Нобавлают сульфат ВММониа до 38-45%-ного насыщения. Оставляют при температуре 4-5 С в течение 2 ч, цен трифугируют.

В надосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 65-70%-ного насыщения. о

Оставляют при температуре 4-5 С в течение 10 ч. Бентрифугируют. Осадок pacw воряют в дистиллированной воде. Ииализуют 24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в диалиэате - центрифугируют. Ниализат лиофилизуют.

Пример получения гиалуронидазы. К

100 мл оттаенной спермы добавляют

400 мл 0,15 М раствора хлористого натрия в дистиллированной воде. Устанавливают рН 6,0. Смесь медленно перемешио вают при температуре 4-5 С в течение

4 ч. Бентрифугируют. Прибавляют 195 г (60%) сульфата аммония. Оставляют при о температуре 4-5 С в течение 4 ч. Цеи1 рифугируют. Осадок растворяют в 70 мл дистиллированной воды. 0иализуют в течение 24 ч против проточной дистиллированной воды. Удаляют выпавший осадок центрифугированием.

632703

Составитель A. Бочарев

Редактор Л. Емельянова Техред Я, Бабурка Корректор Н. Ковалева

Заказ 6497/22 Тираж 517 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

К 75 мл диализата добавляют 450 мл

0,15 М раствора хлористого натрия (концентрация белка 1 мг/мл по Lonry ).

Объем 525 мл. добавляют 127,6 r сульфата аммония (40/о). Оставляют при тем- % о пературе 4-5 С в течение 2 ч. Бентрифугируют, К недостаточной жидкости добавляют

88,1 r сульфата аммония (65%). Осгаво ляют при температуре 4-5 С в течение Ф

10ч. Бентрифугируют. Осадок растворяют в 50 мл дистиллированной воды. анализу ют 24 ч против проточной дистиллированной воды. Удаляют выпавший осадок цент рифугированием. Йиалиэат — 50 мл лиофи-И лизуют. Выход — 2,5 r, активность

680 МЕ/мг.

Формула изобре гения

Способ получения гиалуронидазы экст ракцией из семенников крупного рогатого скота и фракцнонированием сульфатом 8Мо моння при температуре 0-5 С с последующим диализом и лиофилиэацией, î r л ич а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения активности и выхода целевого продукта, экстракции раствором хлористого натрия при рН 5,8 — 6,3 подвергают сперму крупного рогатого скота, забракованную для искусственного осеменения, причем 1 фракционирование ведут 60-65% ным насыщением сульфата аммония, И фракционирование проводят на стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммония до 38-45%ного насыщения и 65-70%-ного насыщения.

Источники информации, принятые во внимание прн экспертизе:

1.К.Ме ег, H aKuronidases,ТЬе Enzwrnes ed Р.9a>er,v.5, р.3о7, 3974

2. Патент Великобритании. )4 682933, 1952.