Способ очистки гамма- -глутамилтаурина

Способ очистки гамма- -глутамилтаурина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

< 638243

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 28.04,75 (21) 2129107/28-13 (23) Приоритет — (32) 29.04.74 (31) FE-928 (ЗЗ) BHP (43) Опубликовано 15.12.78. Ьюллете Ib М 46 (45) Дата опубликования описания 26.02.79 (51) М.Кл. А 61 К 35/12

Государственный комитет (53) УДК 615.45:615. .361.447 (088.8) ио делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Ласло Фойер, Арпад Фурка, Ференц Шебештьен, Йолан Херчел и Эржебет Бендефь (BHP) Иностранное предприятие

«Хиноин Дьедьсер еш Ведьесети Термекек Дьяра, з Т» (BHP) (71) З,аявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ

ГАММА-L-ГЛ УТАМ ИЛТАУР И НА

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно получению гормональных препаратов.

Известен способ очистки гамма-1 -глутамилтаурина путем гель-фильтрации, отбора активных фракций спектрографическим методом с последующей лиофилизацией целевого продукта.

Однако известный способ не обеспечивает высокой чистоты препарата.

Целью изобретения является повышение чистоты препарата.

Эта цель достигается тем, что полученный после лиофилизации продукт растворяют в воде, водный раствор очищают последовательно с помощью ионообменнои хроматографии, электрофореза и выделяют целевой продукт хроматографически.

Способ осуществляют следующим образом.

Околощитовидные железы млекопитающих или их тканевую или клеточную культуру, предпочтительно в форме порошка, экстрагируют водой или водным раствором, содержащим неорганические ионы, экстракт фильтруют и затем производят обработку средством, способным осаждать белки.

Осадок подвергают гель-фильтрации. Зате л применяют полученный концентрат.

Из этого концентрата посредством спектроскопического определения выбирают фракцгцо, обнаруживающую два максимума (фракция В); эту фракцию отделяют и подвергают очистке с помощью ионообменной «роматографии. После этого полученный концентрат подвергают электрофорезу, который осуществляют при рН 1,8 и относительно высоком напряжении. Чистый продукт получают с помощью «роматографии.

Для понообменной «роматографпи применяют синтетическую смолу «Дауекс 50..> или другую синтетическую смолу подобног.i

15 типа.

В процессе электрофореза гамма-1 -глутамилтаурин перемещается в направлении анода.

Хроматографическое отделение, пред2О ставляющее собой последнюю стадию выделения, осуществляют в виде бумажной

«роматографии или «роматографии на колонке, заполненной целлюлозой. На этой фазе определение отделяемого аминокис25 лотного производного производят нингидрином. Чистое биологически активное вещество может быть получено этим способом в концентрации, которая в десять тысяч — сто тысяч раз больше, чем его концентрация в высушенной околощитовидной

638243 железе. Любые фракции, получающиеся в ряду операций очистки, также .могут быть использованы для терапевтических целей.

Результаты элементарного анализа и определения молекулярного веса хорошо согласуются с рассчитанными значениями для формулы C>HI4N>O S и следующего состава, %:

С 33,07; Н 5,55; N 11,02; О 37,75; S 12,61;

М 254,.27.

Из ИК-спектра (КВг) следует, что SO> и NH + имеют цвиттерионную структуру; свободная карбоксильная группа недиссоциирована.

Характеристические полосы поглощения:

1 (ОН), (U!H.) около 3600 — 2400 сл —

U (NH) около 3315 сл-

U (СО) валентные колебания карбоксильной группы около 1758 сл

U (CO) амидный карбонил (1) около 1662 сл-

S (NH3) + около 1576 сл-

U (SO; ) — около 1296 — 1031 сл -

Данные спектра ЯМР гамма-L-глутамилтаурина: химическое смещение (6): 4,15 (/У, СН);

3,65 (m, 2, СН); 3,12 (m 2, "CH); 2,7 — 2.1 (m 4, зсн4СН2).

Протоны Химическое Относисмещенпе тельная интенсивность

СН вЂ” NH 4 15 (i) 1

СН2 — Soçí 365 (m) 2

СН вЂ” NH 3,12 (m) 2

О=С вЂ” ГН,— CH — ОН 2,7 — 2.1 (m) 4

Соединение, перекристаллпзованное нз содержащей 80 об, оо этанола смеси этацола и воды, имеет следующие кристаллографические данные: размер элементарной ячейки (определен фотографическим методом Вайссенберга): а=6,69 А, b=7,87 А, с=11,38 А, (5=101 . Кристаллы прннадлс кат к моноклинной кристаллической системе и к классу Р2ь Плотность измеренная

1,55 г/см, плотность рассчитанная 1,552 г!

/„. „3

Скорость электрофоретпческой миграции хорошо согласуется с рассчитанным значением. В случае применения цистепновой кислоты в качестве стандартного вещества она составляет в рассчете на это вещество 0,74 (рН 6,5, напряжение=1500 Г время 90 мин, нагрузка 0,03 р М/см, бумага: ватман 3 лл).

Оптическое вращение (а)д =+14 (вода, с=1,021%), Т. разл, 223 — 226 С.

После гидролиза в гидролизате с помощью аминокислотного анализа тора можно обнаружить глутаминовую кислоту, а посредством хроматографического опреде10

Зс

65 ления в тонком слое можно обнаружить таурин.

Стабильность чистого, выделенного из околощитовпд ой железы продукта удовлетворяет требованиям, предъявляемым при применении продукта для фармацевтических целей. У пробы, оставленной на 8 дней в термостате при 70 С, после определения температуры плавления, измерения оптического вращения, а также исследования с помощью хроматографии в тонком слое и проведенного на бумаге электрофореза, не удалось обнаружить разложения.

Выделенное биологически активное вещество обладает широким спектром терапевтического и профилактического действия на прямые или косвенные патологические изменения, связанные с повреждением

«АГАС» (аэробиосферически-генетическая система адаптации).

Соединение оказываст на органы и ткани указанной системы благоприятное биологическое или терапевтическое действие.

Соединение оказываст защитное дсйствие от излучений от постоянно возрастающей опасности заражения и загрязнения кожи и слизистых оболочек, действие, способству1ощее заживлению ран, активирующее зародышевую соединительную ткань, активирование мерцательного эпителия в дыхательных путя.; и так далее, а такж обладает повышенной защитой от инфекций, вызываемой грибками.

Соединение активно против постоянно существующих и возрастающих в большой степени стрессовых воздействий (например, метеорологические воздействия, больши . различия между дневной и ночной температурой, большая опасность поьреждения) на материке, Соединение частично проявляет свое действие непосредственно, частично через регулирование витамина А в обмене веществ.

Время лечения полученным препаратом может быть самым различным.

Симптомы некоторых заболеваний (например, Rhino-1агуngopharyngitis Sicca) исчезают при оральном введении ежесуточно Зх5 лкг уже через две недели; для симптоматического улучшения других болезней (например, парадептозе, Sjogren-Synd! om) необходимо до двух месяцев; при других болезнях (например, Spondee losis

Ап14у1opoltiсa) лечение необходимо проводить от трех месяцев до полугода.

Препарат может содержать одно биологически активное вещество или же комбинацию оиологически активных веществ. Дозы чистого биологически активного вещества составляют 50 — 500 нг на день на килограмм веса тела и применяются разделенными на три разовые дозы.

Таблетки содержат 2 — 20 мкг, 10 мкг биологически активного вещества и, кроме

638243 того, инертный в биологическом отношении носитель (например, молочный сахар, крахмал), а также обычные при приготовлении таблеток вспомогательные вещества (гранулирующие вещества и вещества, придающие скользкость, например, поливинилпирролидон, желатина, тальк, стеарат магния, аэросил и так далее). При очень малых дозах целесообразно перел гранулированием прибавлять биологически ак ивное вещество в форме раствора к массе для таблетирования и производить гомогенизацию в смесителе. Малое содержание биологически активного вещества дает возмо>кность производить приготовление препарата в большой лаборатории. Биологически активное вещество стабильно, поэтому таблетки могут быть выпущены в продажу без указания срока применени>-:.

Содержание биологически активного вещества таблеток замедленного действия, плп спансулярных капсул может составлять

10 — 20 11кг. B случае препаратов для инъекций наиболее целесообразная доза на ампулу составляет 5 — 10 я1кг. Парентеральное применение может быть произведе«1о внутримышечно, подкожно или внутривенно. В указанных концентрациях биологически активное вещество не повреждает ткани и стенки сосудов, в связи с чем оно может оыть применено в виде препарата для вливания.

Пр и м е р 1. Получение гамма-1-глутамплтаурппа из природных веществ.

10 г лиофплизованного и перемолотого порошка. полученного из околощитовидно "1 железы, обез>киривают известным способом

Луербаха следующим образом: полученный из желез порошок при комнатной температуре основательно перемешивают

25 лл ацетона и затем суспензию фильтруют через стеклянный фильтр. Хорошо отжатый порошок желез тщательно растирают с хлороформом и полученную суспензпю вновь фильтруют через стеклянный фильтр. Эту стадию повторяют еще раз.

Непосредственно после этого отфильтрованное вещество еще раз суспендируют в

25 тя 1 ацетона и основательно отсасываюс помощью стеклянного фильтра. Очищен.>IЬIИ IIOPOIIIOI< СУПЕа1 f В В21 ЕУ> МЕ ПРИ КОМН 2Т ной температуре. Получают примерно

7 — 9 г сухого обезжиренного порошка желез. Вес продукта зависит от содержания жиров в исходном материале.

10 г сухого обезжиренного порошка желез эстрагируют три раза при 30 С Ilo

300 л.1 дистиллированной волы. Каждая операция экстрагирования длится 1 ч. После каждой экстракции водный раствор о деляют от порошка желез с помощью центрифуги с большим числом оборотов. До последующего применения водный экстракг хранят в атмосфере азота в холодильнике при (— 3) — (— 5) С. Водный экстракт

77 — 103

77 — 103

104 — 128

129 †1

135 †1

163 †1 лает положительные реакции с нингнлрпном, бпуретом и трнхлоруксусной кислотой.

Незадолго ло операции водные экст5 ракты о ъелпняют. К объединенному экстракту прп постоянном встряхивании прибавляют по каплям столько 50%-ного по объему водного раствора трихлоруксусной кислоты, чтобы конечная концентрация

10 трихлоруксусной кислоты составляла 15 1>.

Солер>каццш осадок водный раствор выдерживают в течение 2 ч в хололильн;ке прп 3 — 5 С и затем посредством центрпфугпрованпя отделяют осадок, об15 разовавшпйся в результате воздействия трпхлоруксусной кислоты. Прозрачный раствор прп дооав leIIIIII TpIIxлоруксусной кислоты не лает осадка.

Изоыточное количество трихлоруксусной кислоты улаляют многократной экстракцпей прп комнатно11 температуре. Для экстра кпе!11 прнменяlОт дпэтеЕловый эфеlр.

Для того..тобы удалить весь избыток трихлоруксусной кислоты, необходимо провести 17 — 18-кратное, в некоторых случаях, даже 20 — 25-кратное экстрагирование. После последней экстр акцпи водн2я фаза пмеет рН 4,5 — 5, Для удаления эфира через водную фазу пропуc«21ox прп 30" С с помощью водоструйного насоса ток азота. Примерно через 6 ч уладя:от весь эфир, полноту удаления проверяют по запаху.

После этого водный раствор подвергают

З5 лпофпльной сушке и вещество, llof ольку оно гпгросе опично, хранят в хорошо закрытом сосуде. Выход вещества в расчете на сще пеобезжпренный порошок составляе

10 — 15оео, что зависит от содержания жиров

40 в псхоЛном, полученном пз жиров порошке.

Полученное лпофилпзованное вещество подвергают гель-фпльтрашш на сефадексе

G-15 нисходящим метолом.

Диаграмму элюпрованпя определяют нзмерснпсм экстпнкцнп при 280 ílf. При это (сухел12рно пол1 ч21от 7 максимумов (IIII,ioII) (.з — G) .

Характеристические параметры гельфпльтрацпп приведены ниже.

50 Исхолпая смесь лпофплпзованного вещества. раствореЕшого в 10 .Пл дистиллированной волы. г 5,1

Диаметр колонки, сеи 4,85

Высота колонки, с.ч 149

Скорость истечения, 111, .11ин 0.78

Время, >яин 10

Bef III÷;;H2 фракций, л.i, ïpoáèpêó 7.8

Максимi м (ппк) . 111сло пробирок

Л

Б

С

65 E

638243

190 †2

218 †2

Вес, лг (после лиофилизации)

8,4

18,4 35

64,4

5,2

2,2

0,2

3,1

7,3

6,8

Количество пробирок

9 — 12

13 — 17

18 — 23

24 — 29

30 — 36

37 — 42

43 — 50

51 — 57

58 — 80

Фракция

А

В

С

Е

G

Н

Формула изобретения

Составитель С.

Малютина

Текред С. Антипенко

Редактор П. Потапова

Корректор И. Симкин"

Заказ 1006/1565 Изд. ¹ 796 Тираж 666 Г!одписное

Н11О Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харви. фил. пред. «Патент»

Активное вещество находится во фракции В. До пробирки № 104 объем элюата составляет 814 и г. Общий объем фракции В составляет 188 лл.

Непосредственно после этого фракцию В подвергают лиофилизации. При 5 г исходного вещества получают 0,43 — 0,53 г лиофил изата.

Пример 2. Лиофилизованную фракцию В подвергают ионообменной хроматографии.

301 г лиофилизованной фракции В растворяют в смеси муравьиной кислоты и уксусной кислоты рН 1,8. Порошок готовят из 86 лл ледяной уксусной кислоты и 25 я.г муравьиной кислоты (88 об. %), разбавляют дистиллированной водой до 1000 м,г и получают 30%-ный раствор. Раствор хроматографируют на колонке величиной

132><1 ????, ?????????????????????? ???????????????? 50><2, при поддержании рН 1,8 смесью муравьиной и уксусной кислот, причем скорость истече- 25 ния составляет 13 лл в час, а фракции составляют по 4 лл, Эти отдельные фракции, принимая во внимание их максимум экстинкции, измеренной при 200 нл, объединяют в фракцию А — 1:

116,3 (38,6% )

Активное вещество находится во фракциях D, Е и F. В результате лиофилизации объединенных элюатов,этих трех фракций получают 7,9 мг вещества, что соответствует 2 62% от подвергнутой гельфильтрации исходной фракции В.

Полученные после ионообменной хроматографии и последующей лиофилизации фракции D, Е и F подвергают электрофорезу при рН 1,8 на бумаге шириной 3 мгг при напряжении 1500 V в течсние 90 яин.

Активное вещество дает положительную реакцию с нингидрином и перемещается or линии старта только в направлении положительного полюса, а именно при напряжении 1500 V.

После электрофореза вырезают показывающие положительную реакцию по отношению к нингидрину полосы, которые содержат вещество, обладакицее соответствующей скоростью перемещения, и переносят на новый лист хроматографической бумаги таким образом, чтобы направления проявления были противоположны направлению электрофоретического перемещения.

Дальнейшую очистку производят с помощью нисходящей бумажной хроматографии, В качестве элюирующего средства применяют смесь бутилового спирта, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды, взятых в соотношении 15: 10: 3: 12. Осуществляемую при комнатной температуре на ватмане 3 млг бумажную хроматогра. фию проводят в течение 60 ч.

При использовании указанного элюирующего средства чистое соединение имеет значение Рг 0,09. Относительная подвижность (по отношению к цистеиновой кислоте), определенная электрофоретически на бумаге при рН 6,5, составляет 0,74. После гидролиза продукта соляной кислотой в гидролизате обнаруживают глутаминовую кислоту и таурин. Выделенное вещество не гидролизуется карбоксипептидазой, Ф ор мул а C 7Í 4N20вЯ, М = 254,27.

Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата высокой степени чистоты.

Способ очистки гамма-L-глутамилтаурина путем гель-фильтрации, отбора активных фракций спектрографическим методом с последующей лиофилизацией целевого продукта, отлич а ющи и с я тем, что, с целью повышения чистоты препарата, полученный после лиофилизации продукт растворяют в воде, водный раствор очищают последовательно с помощью ионообменной хроматографии, электрофореза и выделяют целевой продукт хроматографически.