Способ получения -лизина

Способ получения -лизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

<»i638268

ОЛ ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

М ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 18.02.77 (21) «9453252/28-13 (23) Приоритет — (32) 20.02.76 (31) 17518/76 (33) Япония (43) Опубликовано 15.12.78. Бюллетень ¹ 46 (51) М Кч з С 12 D 13/06

Государственный комитет (53) УДК 668.394 (088.8) по делам изобретений и открытий (45) j,àòà опубликования оппса1шя 22.01.79 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Осаму Тосака, Хадзиму Мориока, Хаяо Хиракава, Кендзи Исии, Кодзи Кубота и Есио Хиросе (Япония) Иностранная фирма

«Адзиномото КО И Н К» (Япония) (71) Заявитель (Я) СПОСОБ ПОЛУЧ EH ИЯ 1-ЛИЗИ HA

Изобретение относится к области микробиологической вромышленности, к технике получения L-лизина при помощи ферментац,ии.

Известен способ получения 1-лизина путем атыра щивания проду цирующих его микроорганизмов,на питательной среде, содержащей источ ники углерода, азота, необходимые минеральные соли, в присутствии стимуляторов роста с последующим выделением L-лизина из культуральной среды (1).

Известный способ,не обеспечивает достаточно высокого выхода аро1дукта.

Целью, изобретения является повышение выхода 1 -лизина.

Это достигается тем, что,в предлагаемом способе получения 1 -лизина:в качестве мик роортанизмов, продуцирующих L-лизин, используют штаммы Brevibacterium lactofermentum РЕЯМ-P 3382, FERM-P 3383, FERN

P 3384, FERN-P 3386, РЕРМ-P 3387 или Corynebacterium aceteg1utamicum РЕКМP 3380, РЕЯМ-P 3381 или FERN-P 3414, устойчивые по отношению,к а-аминолау риллактаму, у-метиллизину или N" -карбобензоксилизину.

Кроме того, используют штаммы, стойкие к S- (2-аминоэтил) -L-цистеину.

Способ осуществляют следующим образом.

Лактофермент Brevibacterium, АТСС

13869 подвергают воздействию 250,цг,ëë

5 11-метил-N -нитро-Х-,нитрозогуанидина прц

30 С 30 лшн.

Обработанные штаммы наносят на ITëocкую агаровую среду А следующего состава, г/дл: глюкоза 2; карбамид 0,3; (ХН4)з$04 1;

10 КНрР0„0,1; Mg$0 . 7Н20 0,04; FeSO,Õ

Х7Й20 1 .иг/дл; Мп$04 4Н20 1 лг!дл; биотпн 50,иг/л; тиамин НС1 100 лг/.1; агар 2;

N " -карбобензоксилизин 0,1.

Образовавшиеся на плоской среде,коло15 нии разделяют и нз колоний отделяют продуцент лизина мутант А1 3985, другие мутанты отделяют таким же образом.

Микроорганизмы выращивают на среде

2О А при 30 С 24 час, выращенные клетки собирают, промывают средой Б, а затем суспендируют в среду В. Среда Б имеет следующий состав, г/дл: экстракт дрожжей 1; пепгон 1; NaC1 0,5; глюкоза 0,5; агар 2,0 (рН 7,0).

Среда В имеет следующий состав. г/дл: г;I10KO3a 2; (Н4) gSOg 1; КН-Р04 0,1;

Мд$04 . 7Н20 0,04; ХаС1 0,05; СаСО> 3;

Fe$O 7НзО 1 мг/дл; Мп$04. 7Н 0 1 мг/дл

638268

Таблица 1

Химtt÷åñêèå добавки

Относительный рост

Микроорганизм назва. ие кол ьиество

100

12

0,1

0,I

0,025

КБЛ

МЛ

АЛЛ

АТСС 13869 ".!

ttt tt

А1 3985

0,1

МЛ

Лl 3986

О,i

1

КБЛ

Л1 3987

0,1 (!

Л1 3988

АЛЛ

0.025

Л1 3989 " ""

КБЛ

0,1

А! 3990 "

КБЛ О, l

МЛ 0,1

АЛЛ 00!

1 00

26!

АТСС 15806 ""

РОО 95

Л1 3991

МЛ (0,1

100

КБЛ (01 93

А! 3983! !оо!

ЛЛЛ Оти

Л! 3984

" ATCC 13869 является исходным штаммом для А! 3985, Al 3986, A!3987, А1 3988, А! 3989 и А1 3990.

"": A!3989 «AI 3990 выращива отся в среде Б, содержащей, кроме того, 500 иг/.ил L-аланнна и 5 иг/ил Illit(oòèíàìèäà.

ATCC 15806 является исходным штаммом для Л! 3991, AI 3983 и Лl 3984. (стерилизованный); биотин 50 мг/л; тнамин . НС! 200 мг/л (рН 7,0) . каждыми 0,1 мл взвеси клеток засевают

3 мл среды В, содержа щей определенное количество и-аиминолауриллактама (АЛЛ), у-метиллизина (МЛ) или Х "-карбобензоксилизи на (КБЛ), ги микроорганизмы выраА! 3445 (АЕСу) является мутантом, про.:изво дящим L JIH3HIH, вила лактофермент

ВгеиЬас1ег!шп, который не ооладает стойкостью,по отношению к КБЛ, МЛ или АЛ

Полученные мутанты могут производить большое количество 1-лизина в среле лаж: в том случае,,когда обладают только теми характеристиками стойкости к АЛЛ, .ЧЛ "::

КБЛ, которые приведены выше: Если опи ,имеют дополнительную стойкость по от ;о:-вению к S-(2-аминоэтил) — 1 - цистеину (АЕС) или потреблению ала нина, то производство 1-лизина значительно возрастает. щивают в п робирке на 10 мл чри 30 С

20 час при периодическом взбалтывании.

В процессе выращивания рост, взвеси определяют, измерением оптической плотности в 562 мм бульона культуры, разбавленной 1: 26. В табл. 1 п риведены полученные результаты.

В качестве источника углерода могут быть использованы карбогидраты: глюкоза сахароза, меласса или гидролизат крахмала; органические кислоты: уксусная, пропионовая или бензойная; спирты: этанол, пропанол; а для,некоторых штаммов — угл

ВО!ДОРОДЬ1.

15 В качестве источника азота можно использовать аммиак, сулъфат аммония, нит рат аммония,,фосфат аммония, .мочевину т. д.

В качестве ростовых веществ можно использовать гид!ролизат соевых бобов,,пше638268

Количество накопившегося 1 -лизина, г/л

Микроорганизм

А! 3985

А! 3986

А1 3987

А! 3988

А! 3989

А1 3990

AI 3445

2,0

1,5

27

28

37

36

Таблица 4

Вв.,оц 1 -л .зина на раскол

3T: oil0l(1 спирта, о.!

Количество пако::!:вшсгося

L-.÷ из шш, г,л

Микрооргапизгс

А1 3988

AI 3989

А1 3990

А! 3445

24

32

63,83

45

Таблица 3

Коли;сство, накопившегося 1 -лизина, г/л

Мпкроорганизги

А1 3983

А1 3989

А! 3990

А! 3445

85 о6

94

4! яичный концентрированный,раство р, экстракт дрожжей или,пептон.

Выращивание осуществляют в аэробных условиях при 24 — 37 С в течение 2 — 7 дней при рН 5 — 9, поддерживаемом добавлением щелочи,,кислоты, карбоната кальция или газообразного аммиака.

1-лизин отделяют от среды с помощью ионообмBHIHûõ смол или к риcTаллизацией.

Пример 1. 20 мл среды выращивания культуры, состав которой приведен ниже, помещают в колбу емкостью 500 м.г, которую периодически взбалтывают .и нагревают до 110 С 5 мин.

Состав среды, г/дл: глюкоза 10; сульфат аммония 5; КНзРО4 0,1; MgS04. 7Н О 0,04;

FeSO4 7Н О 1,0 мгlдл; Мп504 4Н O

1,0 мгlдл; биотин 5,0 мгlдл; тиамин НС1

20,0 ма/4л; гидролизат соевых бобов

1,5 мг/дл (общее содержание азота 7%); карбонат кальция (стерилизова нный) 5% (рН 70).

Каждый вирд микроорганизмов, приведенных в табл. 2, п рививают,на среду для выращивания,культуры и температуру,среды,поддерживают на у ровне 31 С 72 час, при этом периодически;взбалтывают.

Таблица 2

После за вершения процесса выращивания опрелеляют общее содержание 1 -лизина в;полученном таким образом медиуме (в табл. 2 это количество приведено в виде гилгрохлорила 1 -лизина) .

Пример 2. CoryIIebactel ium acetog1utamicum AI 3983, Al 3984, А1 3991 или

АТСС 21491 (AEC) выращивают, как в примере 1. В соответствующей среде для выращивани я культуры обнаружи вают произведенный 1 -лизин в количестве 25, 24, 3,0 и

15 г/л, соответственно.

П р.и м е р 3. Микроорганизмы, .которые приведены в табл. 3, выращивают аэpo6lHo в 50 мл среды, содержащей вытяжку H3 семя н, при 31 С 18 час.

1с

Соста з среды, содержащей вытяжку нз семян, ггдл: глюкоза 1,5; ацетат аммония 0,3 хгочевина 0,1; Л1р804 . 7НзО 0,4; 1;Н Р04

0,01; Мп >04 - 4Н,.О 1 мггд.г; Ге504 7НаО

1 мг дл; бнотнн 50 мг .г; тнамин НС!

200 мг/л; гилролизат соевых бобов 3 лиг, дл (общее содержание азота 7% рН 7,5).

Триста частей среды лля выращивания культуры, состав которой привелен,выше, помещают в сосул,лля ферментацнн объемом 1 л, нагревают, а затем в сосул вносят

15 мл бульона среды cocTaiaa, г,дл: глюкоза

2; ацетат аммония О 5; гмочевина О "; (XH4) ЬО 0.5: КНвРО 0,1; Мд504 7Н О

0,04; ГеЯО 7Н.О 1 мг/дл; Мп504 4НаО

1 мг д.г; бнотнн 50 лгг .г; тиамин бО мг/л; гилролнзат соевых бобов 3 рмг/дл (рН 7,5).

Выращпвангне осуществляют аэробно при 30 С. В процессе выращивания лобавляют волный раствор. содержащий уксус|ную кислоту и ацетат аммония,,лля поллержания,рН среды на уровне 7,2 — 8.0.

Спустя 72 час в процессе выращивания в образовавшейоя таким образом среде гнакапливается 1-лизин, общее количество которого приведено в табл. 3. гПример 4. Микроорганизмы, приведенные в табл. 4. выращивают аэробно при

31 С ia течение 18 час в 50 мл срелы лля выращивания культуры согласгно примеру 3 с добавлением 0,5 г дл этилового спирта и

0,3 г/дл мочевнны вместо 0,3 г/дл ацетата аммония и 0,1 г, дл мочевпны.

Порлнн объемом 300 мл той же срелы, которую используют в примере 3. с концентрацией глюкозь! 1 г, дл и лобавленне» 1 г.дл эти,IQBoãо спирта вместо 0.5 г,дл ацетата аммония, помещают в сосул лля ферментацни, объемом 1 л и госуд нагревают. Срелу

Лля выращизання к»льт!.ры помещают в бульон семенной культуры объемом 15 игл, с о с т а в к о т о 1з о и Ilp I II c л е н H bl tll p. В ы р а щ и в ание осуществляют аэробно при 31 C.

В процессе выращивания рН срель! поллерживают 7.2 — 8,2 прн помощи газообразно"o аммония. Концентрациго спирта э среле лля выращггван:!я культуры пернолнческн контролируют прн помощ:I газовой хроматографии. ноллсрживая на уровне 0,3 г дл полппнткой этнлозым спиртом.

Преллагаемый способ обеспечн по сравнению известным повышенный выход

1 -лизина.

638268

Табтица 5

Количество иаконившег0c51 I.-лизина, г/л

"11ик1!)oopraíèçì меласса свеклы ме1асса тростника

19 27

29

37

18

23

AI 3445

А1 3937

А! 3988

А I 3989

ЛТСС 21491

AI 3983

AI 3984

27

39

26

Формула изобретения

Составитель А. Бражникова

Текред С. Антипенко

Корректор С. Файн

Редактор Е. Хорина

3аказ 989/1567 Изд. No 791 Тираж 526 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

Выращивание осуществляют 5б час. B табл. 4,приведены количества I -лизина, которые были .найдены в соответствующих средах.

П p;r м е,р 5. Приготавливают среду для,выращиBBHия культуры, состав,кото рой приведен, ниже, и 20 мл среды помешают в ,колбы объемом 500 мл, среду нагревают,,периодически взбалтывался.

Приготавливают 1 л бульона, засеянного микроорганизмами вида AI 3989, как описано выше, затем засеянный бульон помещают в центрифугу для извлечения клеток;,всплы,вающую часть среды обрабатывают кислой ионообменной смолой «Amberlite IR-120 .

Абсорби рованный на смоле I .лизин вымывают 3%иной аммиачной водой, а из элюата извлекают кристаллы двугидрата гидрохлорида 1-лизина (28,5 г).

1. Способ, получения 1 -лизина путем вы ращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, в присутствии стимуляторов роста с последующим,выделением 1-лизина .культураль ной среды, о т л и ч а юСостав среды, г/дл: меласса свеклы или меласса тростника 10 (источник глюкозы); сульфат аммония 5; КН РО» 0,1; MgSG

<7Н;О 0,04; биотин 0,5 пг/л; СаСО> 5 г/дл

5 (отдель но стерилизуют) .

Середу засевают микроорганизмами, которые приведены .в табл. 5, и,выдерживают при 30 С 72 час, периодически, взбалтывая, Полученная среда содержит 1 -лизин в количествах, которые, приведены в табл. 5.

10 шийся тем, что, с целью повышения,выхода, в качестве микроорганизмов, продуцирующих 1 -.лизин,,используют штаммы

Brevibacterium lactofermentum FERrMP 3382, FERM-P 3383, FERM-P 3384, 15 РЕКМ-P 338б, FERM-P 3387 или СогупеЬасterium acetoglutamicum FERN-Р 3380, ЕЕКМ-P 3381 или г ЕКМ-Р,3414, устойчивые по от ношению,к а-аминолауриллактаму, т-мети ллизину,или N™ -,карбобензоксилизину.

2. Способ,по п. 1, о тл,ич а ю щи йс я тем, что,используют штаммы, стойкие к S(2-аминоэтил) -I -,цистеину.

25 Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР

М 378411, кл. С 12 D 1,3/Об, 1971.