Способ получения -лизина

Способ получения -лизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(6)) Дополнительный к патенту (22) ЗанвлЕно ) 5. 10. 76 (2)) 2410957/28-13 (51) M. Кл, С 12 Д 13/06 р ) 17.10.75

22. 10.75 (33) Я»»я (23) Приоритет (З)) 125789/75

127817/75

Государственный коинтет

СССР по делам нзобретеннй и открытий

Опубликовано05.01.79.Бюллетень № 1

Дата опубликовании описания 08 01.79 (53) УДК 668.394 (088.8) Иностранцы

Тутому Танака, Есио Накамура, Кодзи Асахи, Тадаеси Сираиси . и Кендзи Такахара (Япония)

Иностранная фирма

Канигафучи Кагаку Когио Кабусики Кайся (Япония) (72) Авторы иаобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L - ЛИЗИНА

Изобретение относится к технике получения Q -лизина путем культивирования бактерий вида Noс,a t c31а на питательной среде.

Известен способ получения I -лизина путем культивирования продуиирующих его микроорт анизмов рода Й О C,CI гC31D в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли с пос- 1а педующим выделением Ь -лизина (1).

Недостатком известного способа является то, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода, -лизина.

Белью изобретения является повышение ц выхода ), -лизина.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения I,- лизина из рода ИОСОгД1се используют штаммы 20

Иосагй1сй аИ<с(падЬз), ттаоьс» А22359 (АТСС 31220) и И»223-15 (ATCC 31221), устойчивые к Ь -(2-аминоэтил) L, — цистнну.

При этом в качестве источника углерода используют животное масло или жир, или растительное масло.

Кроме того, в качестве источника углерода используют жирную кислоту.

Кроме того, в качестве источника углерода используют этиловый спирт.

Кроме того, в качестве источника углерода используют глюкозу или фруктозу, или крахмал, или продукт гидролиза мелассы или крахмала.

Кроме того, в качестве источника углерода используют уксусную кислоту или лимонную кислоту, А также, кроме того, в качестве источника углерода используют тт -алкая, содержащий от 14 до 19 атомов углерода или керосин, или сырую нефть, содержащую lq «алкан, При этом рН питательной среды после культивирования микроорганизмов доводят до 1-3 и выдержаивают s течение о

5-120 мин при 80-100 С, 641874

Кроме того, рН питательной среды после процесса культивировании микроор:ганизмов доводят до 7-9 и выдерживают от 5 минут до 5 суток при 80100 С. S

Способ осуществляют следующим образом.

Продуцирующие L -лизин микроорганизмы иэ рода ИОС<мгЖакультивируют. в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли.

Иэ рода МОСс гd10l используют штаммы йосси с3 (О ОИ(ойОЯ Eut1housa, ¹ 223«59 (АТСС 31220) и ¹ 22315 (ATCC 31221), устойчивые к 5-(2-аминоэтил) L -цистину {А С) .

Микробиологические свойства указанных штаммов аналогичны микробиологи20 ческим GBoHcTBBM исходного штамма № 223, за исключением того, что первые два штамма обладают стойкостью к АЕС, а последний нуждается в помосе рине.

Морфология, Форма. Ранняя стадия выращивания: 0,8-1,0х 4-1 5, прямые или изогнутые палочки, отмечается наличие ответвлений; стабильная стадия: сферическая или короткая палочкообраз

ЗО ная, близкая к форме сферы.

Грам-травление положительное, быстрое кислотное травление отрицательное, подвижность отсутствует.

Зндогенные споры отсутствуют кпет3 35 ки на стойкой стадии выращивания выдеро живают при 80 С одчочасового нагрева в физиологическом растворе.

Условия выращивания;

Колония выращена на агаровой плас, о тинке в течение 3 суток при 33 С, форма округлая, рост хороший; окраска бледно-розовая, колония непрозрачная, влажная, гладкая.

Культивирование на скошенном агаре о в течение 3 суток при 33 С, колония нитевидная, рост хороший, окраска бледно-розовая, колония влажная, гладкая, наличия воздушного мицелия не отмечается.

Культивирование на питательном бульбо не.при 33 С. На поверхности образуется тонкая пленка, отмечаются осадки.

Питательная желатина не ожидается, выращивание на поверхности и в верхней части, Локмусовое молоко: щелочная реакция беэ коагуляции или пептизации, Филиологические свойства. Крахмал не гидрализует, восстанавливает нитраты, индол образует, сероводород образует, уреазу не образует, проба 7.Р.отрицательна, испытание метилкрасным о рицательно, реакция на каталазу положительная, целлюлозу не разлагает, потребность в питательной среде отсутствует, разложение дезоксирибонуклеиновой кисло» ты (ДА) отсутствует, чувствительность к лизоцину имеется, эскулин разлагает, к пеницилчину (5 единиц/мл, метод диска) не чувствителен.

Ассимилирует в качестве источника углерода фруктозу, глюкозу, маннитоп, сорбитол, фенол, молочную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, апет амид, тирозин, этаноп, маннозу, Д-алканы,; текстрин, масла и жиры, жирные кислоты.

Образование кислот из сахаров; кислоты образуют из глюкозы, фруктозы, сорбитола маннитола, глицерина и трехалозы, о сутствует образование кислот из ксилозы, галактозы, сахарозы, пактозы, мальтозы, инозитола, декстрина и крахмала.

Оптимальная температура выращивао ния от 30 до 37 С, рост наблюдается в о диапазоне 10-40 С, рН роста 8-9, аэробен относительно кислорода.

Состав клеток. Содержит Хф-диаменопимеповую кислоту, галактозу, и арабинозу.

В питательной среде в качестве источника углерода при выращивании используют животное масло или жир, раститепьн ое масп о, жирные кислоты, э тип овый спирт, глюкозу, фруктозу или крахмал, ппи продукт гидропиза мелассы или крахмала, уксусную или лимонную кислоту, И -алканы, содержащие 10-30 атомов углерода, а также углеводороды, такие как керосин и неочищенная нефть.

В качестве источников азота используют ацетат аммония, сульфат аммония, хлористый аммоний, нитрат аммония, водный раствор аммиака, аминокислоты, смесь аминокислот, экстракт дрожжей, пелтон и экстракт мяса. При необходимо сти вводят также соли неорганических кислот, такие как фосфаты, соли кальция, магния, калия, патрии, железа, марганца, цинка и следы других металлов, Эти компоненты питательной среды вводят до стерилизации или отдельными поршими в процессе ферментацип.

Выращивание осуществляют со встряхиванием или при аэрации и перемешива641874 нии при рН 6-9, предпочтительно 6-8, температуре от 20 до 40, предпочтительно от 27 до 37 С, Питательный бульон после окончания процесса культивирования приобретает значительную вязкость, что препятствует его фильтрации, вследствие чего в него добавляют неорганическую кислоту с доведением рН до 1-3 или щелочь с доведением рН до 9 и более, после чего 0 о бульон подвергают нагреву при 80 С и выше в течение 5 мин. (,-лизин выделяют из фильтрата, например путем адсорбции ионообменной смолой I R -1 20 илп I R-8 4, промывают водой и элюируют аммиачным раствором, Зпюат сгущают, нейтрализуют концентрированной соляной кислотой и высушивают, получая высокочистый гидрохлорид (.-лизина.

Z0

Количество полученного L -линиза оценивают биопробой с использованием мутантного штамма бсйя Р1СЬ3 И СОС1 и с помощью аминокислотного анализатора

Пример 1. Выращенные по полной петле в бульоне на скошенном агаре клетки бактерий Nocavdia a&anog8ut1flousa ¹ 223-59 (АТСС 31220)Ä а также ¹ 223-15 (ATCC 31221) вью держивают в течение суток при 33 С в пробирке, содержащей 1 О мл питател ной среды следующего состава, r: 0-алканы (С,- С„ )- 50,0; сульфат аммония — 40,0; Са СΠ— 30,0; K НРО

0,5; КН РО -0,5; Я УSO 7Н 0-0,5;

NaCE -1,0; Fe 5O4-7H Î -10 мг;

+0504 4.Н 0 — 10 мг; вода водопроводная — 940 мл, pH — 7,0, температу40 ра 120 С (парообразование в течение

15 мин), Культивирование проводят в течение о одних суток при 33 С со встряхиванием.

1 мл полученного бульона выпевают в

500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл той же питательной среды, и выдерживают 5 суток при 33 С с о вс тряхиван нем, При этом получают L-лизин (гидро55 хлорид), г/л: йссагй а а6%апс гбоИПоusa N 223-59 (АТСС 31220)-19,5;

Mocker d a aLtanog 6ut nou sa № 223-15, (АТСС вЂ” 31221)- 28,755

Пример 2. Выращенные вбульоне на скошенном а га ре бактерии Nocardia a6kaпофоОпоьо № 223-59 (АТСС 31220) и выдержанные Ь течение одних суток при 33 С петлей вводят в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую

50 мл питательной среды такого же состава, как описано в примере 1, за тем исключением, что вместо Q -алкана используют кукурузное масло или рыбий

KHP„

Культивирование проводят со встряхи-, ванием. В результате пятисуточного выращивания получают 5,8 г/л L-лизина (в виде гидрохлорида) в случае введения в питательную среду кукурузного масла или 6,3 г/л в случае введения в нее рыбьего жира.

Пример 3. Выращенные в бульоне на скошенном агаре в течение одних о суток при 33 С бактерии Noccvdia aEganog8u

Выращивание проводят в течение о

5 суток при 33 С со встряхиванием, Количество накопленного в виде гидрохлоридов L-лизина составляет 15,3 г/л при введении в питательную среду стеариновой кислоты и 14,4 г/л - при введении в питательную среду маргариновой кислоты

Пример 4. Выращенные на скощенном агаре бактерии МосаиЗш

afkaподBut nouso . ¹ 223-59 (АТСС 31220) вносятпетпейв 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл питательной среды, имеющей такой же состав, как в примере 1, за тем исключением, что вместо М-алканов используют этиловый спирт, вводимый порциями, не превыщающими 1%, Выращивание осуществляют со встряхиванием.

В результате пятисуточного выращивания получают 13 г/л Ь-лизина (в виде гидрохлоридов).

Пример 5 Выращенные в буль не на скошенном агаре в течение одних о суток при 33 С бактерии МОС01ГЙ1о ООяcog Cut nousQ Х. 223-1 5 (АТСС 31 221 ) петлей вносят в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл питательной среды, как в примере 1, где выращивают при 33 С в течение.одних суток со встряхиванием.

5 мл полученного бульона вводят в

2» литровую колбу Сакагучи, содержацую 200 мл такой же питательной срецы, как в примере 1. Выращивание осуществлшот в течение одних суток при

ЗЗ С со встряхиванием. 600 мл полуо ченного бульона переносят в .30 — литро алый сосуд, содержащий 10 мл производящей Ь-лизин среды указанного ниже состава, Культивирование проводят при

ЗЗ С с перемешиванием при 400 об/мин и с пропуском 9 л воздуха в минуту.

В процессе культивирования среду нейтрализуют водным раствором аммиака до рн 7,0. Спустя 96 часов культивирования получают 52,5 г/л ь -лизина (a виде гидрохлоридов), К 1 л полученного бульона добавляют концентрированную серную кислоту, до достижения рН 1 5. Затем осуществляют нагрев при

100 С в течение 20 мин и фильтрацию.

Фильтрат пропускают через иоцообменную смолу типа . IR-120, МН "-, адсорбирующую 1„-лизин. Затем промывают водой и элюируют аммиаком. Элюированные фракции подвергают сгущению, нейтрализации,концентрированной соляной кис= лотой и сушке. Получают 45 r гидре= хлорида L -лизина со степенью чистоты выше 98%.

Состав производящий L -лизин средьг алкан (С вЂ” С1 )

100 г.

Сульфат аммония 35,0 r

СаСь 2FI 0 1,0 г

NaCL 1,0 r

К НРО,„ 1,0 г

Кй F0<

1,0 г

Mg ЯО, 7FI О 0Ä5 г

p е 50, 7Н О 100 мг

Ми О, 4Н О 20 МГ

ZnSO 7Н,О 20 мг

Вода из водопровода 870 мл рН 7,0

Температура 120 С (парообразование в течение 15 мин)

Пример 6. К 1 л полученного в примере 5 питательного раствора добавляют необходимое для доведения рН до 11 количество гидроокиси кальция, о

Раствор нагревают 30 мин при 100 С, а затем в течение двух часов через него пропускают воздух. рН раствора доводят добавкой концентрированной серной кислоты до 5,0. Затем раствор фильтруют, Фильтрат пропускают чере ионообменцук

+ смолу типа И вЂ” 120, М Нл, которая адсорбирует пизин. Далее промываютводой и элюируют аммиаком.

Пери од ильтрации, мин

Элюированные фракции подвергают сгущению, нейтрализуют концентрированной соляной кислотой и сушат. Получают46г

L-лизина (в виде гидрохлорида) с чис5 тотой, превышающей 98%, Пример 7, Выращенные в течео ние одних суток при 33 С в бульоне на скошенном агаре бактерии ЙОСА 3 а дродEvtinousol № 223-15

10 (АТСС 31221) петлей высевают в

500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл питательной среды, аналогичной по составу среде, упомян„ той впримере 1, за тем исключением, что вместо р-алкана используют глюкозу, Культивирование ведут в течение четыо рех суток при ЗЗ С.

Количество накопленного в среде „ -лизина составляет 0,5 г/л (в ви- де гидрохлорида).

Пример 8, Выращенные на скошенном агаре бактерии Косец Д д аИ -а noq5ut O », №223-15 (ATCC 31221), культивирование велось С о в течение 1 суток при температуре 33 С, петлей вводят и 500-миллиметровую колбу Сакагучи, -одержащую 30 мл среды, аналогичной по cocTQBQ среде, использованной в примере 1, за.тем исключением, что вместо Vl -алкана ввсдят уксусную кислоту порциями, не превышающими 0,5%, Далее выращивают в течение четырех„-, о. 1" суток при 33 С, со встряхиванием. Количество полученного в виде гидрохлоида

I -лизин а с ос тавляе т 2 2 r/л.

Пример 9. Штамм Иоса й1С QE4»11одбиОпоо su ¹ 223-59 (ATCC 3 1 270), продуцируюший Ь-лизин, выращивают в питательной среде, содержащей н«-парафин, включающий 14-19 атомов углерода, в качестве основного источника углерода. Питательный жидкий бульон разделяют на порции по 20 мл каждая. Величину рН разделенного питательного бульона регулируют, доводя до

1,5; 2,0; и 3,0, и осуществляют нао о грев при 80 С 5 мин, при 80 С— о

10 мин, при 100 С вЂ” 2 часа, Фильтра цпю осуществляют с использованием

56 стеклянного ф ЗС-2 испиратора, результаты представлены в таблице.