Способ очистки протеолитических ферментов

Способ очистки протеолитических ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ i ц 644796

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 09.06.76 (21) 2370306/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.01.79. Бюллетень № 4 (45) Дата опубликования описания 30,01.79 (51) М,К .

С 07G 7/02

Госудаистваииь::-"; и митет

СССР по дела.".1 иа.беетелий (53) УДК 577.15.04.66 (088.8) и стк зьпий»

«

».. т

»

I (72) Авторы изобретения

В. М. Степанов и Г. Н. Руденская тйи;:.;;.,- .

» ь»»:tg » »: »

1 (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт ген и селекции промышленных микроорганизмов (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к области получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности.

Получение высокоочнщенных ферментов основано на применении различных химических способов очистки. Для этой цели ус- 10 пешно применяется иопообменная хроматография, в частности для очистки и выделения протеолитических ферментов — хроматография на модифицированных силохромах (1). Однако этот метод недостаточно 15 избирателен и не позволяет решить некоторые технические задачи, например извлечение ферментов с высоким выходом непосредственно из смесей с низкой концентрацией активного фермента, содержащих 20 большое количество неорганических и органических примесей (например, из культуральной жидкости).

В связи с этим в настоящее время наиболее перспективным для избирательной очи- 25 стки ферментов является мотод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что 30 позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать более высокой степени очистки по сравнению с другими видами хроматографической техники.

В настоящее время наиболее широко выделение ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецифических сорбентов, представляющих собой нерастворимые носители, производные агарозы, активированные бромцианом и ковалентно связанные с лигандами — специфическими для данного класса ферментов веществами — аналогами субстрата (2, 3).

Известен способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сор бции (3) .

Биоспецифический сорбент представляет собой нерастворимый носитель на основе агарозы, в частности активированную бромцианом сефарозу 4В, ковалентно связанную с лигандом — антибиотиком грамицидином С.

Сорбцию ферментов осуществляют при рН 4,5 с помощью солевого буфера (1М раствор NBC1). При элюировании для полноты десорбции к солевому буферу добавляется органический растворитель. Выход ферментов по активности 78%, степень очистки 16 раз.

644796

30! 4

+ CNB1 С=3Н вЂ” 4 с =щ+1!и

/ 3i

0 0

I. ! — ОН ! !

I-— 0H

55

Данный способ обладает рядом недостатков, обусловленных использованием в качестве лиганда грамицидина С. Грамицидин С сравнительно малодоступен. Синтез сорбента на его основе сопряжен с значительными трудностями, связанными с низкой растворимостью лиганда, из-за чего реакцию грамицидина С с активированной бромцианом сефарозой 4В приходится проводить в растворах с высоким содер>канием диметилформамида, который частично разрушает структуру сефарозы. В ходе синтеза сорбента грамицидин С выпадает в осадок, что приводит к снижению выхода конечного продукта и затрудняет очистку полученного вещества. Кроме того, область применения грамицидина С-сефарозы 4В ограничена некоторыми классами протеиназ и не включает практически важные сериновые протеиназы.

С целью упрощения процесса и повыше ния выхода ферментов высокой степени чистоты и активности описывается способ очистки протеолитических ферментов, заключающийся в биоспецифической сорбции растворенных ферментов на нерастворимом носителе — производном агарозы, в частности сефарозе 4В, активированной бромцианом и ковалентно связанной с лигандом.

Отличительным признаком данного способа является использование в качестве лиганда антибиотика бацитрацина. Таким образом, где R — NH — антибиотик бацитрацин.

Описываемый способ позволяет очищать с выходом 75 — 95% различные протеолитические ферменты с увеличением активности в 2 — 500 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.

Описываемый способ эффективен при извлечении ферментов непосредственно из культуральной жидкости, содержащей окрашенные примеси. С помощью бацитрацин-сефарозы 4В выделяется бесцветный фермент, причем вследствие избирательности сорбента значительный эффект достигается в одностадийном процессе очистки.

Кроме того, описываемый биоспецифический сорбент может быть применен для работы с растворами в широком диапазоне рН (1,8 — 8,0), что дает возможность использовать его для выделения протеолитических ферментов различных классов, включая карбоксильные, сериновые, тиоловые, металлопротеиназы и экзопептидазы.

Способ осуществляется следующим образом.

Раствор неочищенного фермента вводят в конкакт с биоспецифическим сорбентом ба5

25 по изооретению, носителем ферментов служит биоспецифический сорбент «бацитрацин-сефароза 4В».

Антибиотик бацитрацин, используемый в качестве лиганда, представляет собой природный циклододекапептид, содержащий три D-аминокислоты. Он является неконкурентным ингибитором ряда протеиназ.

Зтим обусловлено специфическое взаимодействие описываемого сорбента с протеолитическими ферментами различных классов. Бацитрацин легко растворяется в воде.

Наличие в молекуле большого количества реакционноспособных групп дает возможность проводить синтез сорбента в мягких условиях с различными видами активированной сефарозы. В настоящее время антибиотик бацитрацин является дешевым и легко доступным препаратом, так как в больших количествах выпускается промышленностью для использования в животноводстве, В качестве нерастворимого носителя используется агароза или ее производные, такие как различные виды сефарозы. Материал носителя нерастворим в условиях использования.

Сефарозу 4В активируют бромцианом, а затем активированная сефароза реагирует с антибиотиком бацитрацином по 6-аминогруппе орнитина по следующей схеме цитрацин-сефарозой 4В, используя режим динамической или статической сорбции., При этом происходит избирательное связывание протеиназ с нерастворимым носителем. Затем сорбент со связанным белком промывают соответствующим буферным раствором. При этом происходит отделение примесей, в том числе и окрашенных.

В качестве элюентов используют растворы солей различной концентрации, В тех случаях, когда фермент связывается с сорбентом настолько прочно, что его не удается элюировать, применяя растворы солей, к последним добавляют органические растворители, способствующие более эффективной десорбции.

Очищенный фермент используют в виде раствора или высушивают лиофильно после обессоливания гель-фильтрацией или диализа.

В таблице приведены данные по очистке ряда протеиназ на колонке с бацитрацинсефарозой (22 мл); в экспериментах использованы коммерческий препарат пепсина свиньи, препараты пепсина лошади и

644796

Очистка ферментов на бацитрацин — сефарозе 4В

Нанесено

Элюирование

Выход % активность удельная активность активность удельная активность

Очистка, и раз белок белок активфермент белок е. а . е. а./мг е. а./о. е. ность е. а./о. е. е. а. е, а,/мг о. е. мг мг о. е.

10 11

13

1500

Пенсии свиньи а .и:.

Пепсин лошади

Аваморин

Субтилизин

1620 20

1209 6,3

80 80

192 154

31,2

48 38

60 46

94

8.15

878

72,6

384

586

1110

2,5

0,2

1488

250

3,9

53

8,6

1085,5

164

20,4

73

65,6

0,8

«карбоксильной протеиназы» «аваморина»

Asp. awamori и неочищенная культуральная жидкость Вас. subtilis, содержащая мутантные формы субтилизина. Количество нанесенного и элюированного белка (графы 2, 3, 7, 8) измерено в мг, а также в условных оптических единицах, т. е. в единицах оптической плотности при 280 нм, Активность

В графах 12, 13 приведен выход по белку и по активности. Степень очистки (гра- 10 фа 14) определяется отношением удельной активности исходного раствора фермента.

Пример 1. Получение бацитрацин-сефарозы 4В.

Для синтеза использованы BrCN-активи- 15 рованная сефароза 4В («Фармация», Швеция) и антибиотик бацитрацин ($егча). К

1 r сухой BrCN-активированной сефарозы

4В добавляют дистиллированную воду для набухания, а затем промывают на стеклян- 20 ном фильтре 200 мл 10 — М раствора HCI в течение 15 мин для удаления азида натрия. Затем сефарозу 4В промывают водой до отрицательной реакции на Cl — и помещают в 0,1 М раствор NaHCO3 в 0,5 М 25 растворе NaCI, рН 10. К подготовленной таким образом BrCN-активированной сефарозе 4В добавляют раствор 100 мг (60 мкм) бацитрацина в 5 мл 0,1 М NaHCO3 в 0,5 М растворе NaCI, рН 10. Реакцию проводят 30 при комнатной температуре, поддерживая рН реакционной смеси в пределах 9,5 — 105.

Через 3 ч гель отфильтровывают и промывают раствором 0,1 M КаНСОз в 0,5 М растворе NaCI, рН 10, 0,1 М раствором NaHCO3, 35 дистиллированной водой, а перед опытом— всеми элюирующими растворами. Содержание бацитрацина 2 мкмоль/мл влажного сорбента, Hp имер 2. Очистка карбоксильной про- 40 теиназы из Asp. awamori на бацитрацинсефарозе 4В.

0,1 М ацетатный буферный раствор с рН

5,0, содержащий неочищенную протеиназу

С удельной активностью 3,9 е. а./мг, пропус- 45 ферментов (графы 4, 9) измерена по скорости гидролиза гемоглобина. Степень чистоты ферментных препаратов характеризуется удельной активностью (графы 5, 6, 10, 11, т. е. количеством единиц активности на количество белка, выраженное в мг (е. а./мг) или оптических единицах (е. а./о. е.). кают через хроматографическую колонку, заполненную бацитрацин-сефарозой 4В. Затем сорбент промывают исходным буфером, активный фермент элюируют 1 м NaCI в том же буфере. Удельная активность аваморина в элюате 30 е. м./мг, выход по активности составляет 73%.

Пример 3. Очистка пепсина лошади на бацитрацин-сефарозе 4В.

0,1 М ацетатный буферный раствор с рН

1,8 — 5,6, целесообразно 5,0, содержащий желудочный сок или неочищенный пенсии лошади с удельной активностью 6,3 е. а./мг, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную бацитрацин-сефарозой 4В. Затем сорбент промывают последовательно исходным буфером, 1 М NaCI в том же буфере и 25%-ным изопропанолом в

1 М NaCI, рН 5,0. Собирают изопропанольтом же буфере и 25%-ным изопропанольную фракцию элюата, содержащую активный белок. Удельная активность пепсина в указанной фракции, определенная по методу Ансона, составляет 46 е. а./о. е. После обессоливания на Сефадексе Г-25 раствор лиофилизируют. Получают фермент с удельной активностью 60 ед/мг. Выход по активности составляет 72,6%.

Пример 4. Очистка субтилизина на бацитрацин-сефарозе 4В.

Культуральная жидкость Вас. subtilis

А-50 с рН около 8,0 и удельной активностью 0,018 по синтетическому субстрату— и-нитроанилиду карбобензокси-1 -аланил-1аланил-L-лейцина перемешивают в течение

30 мин с бацитрацин-сефарозой 4В, затем сорбент осторожно отфильтровывают на

644796

Составитель О. Скородумова

Редактор В. Минасбекова Техред Н. Строганова

Корректор Е. Хмелева

Заказ 2701/15 Изд. № 138 Тираж 520 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

7 стеклянном фильтре и промывают 0,1 М фосфатным буферным раствором с рН 6,0—

8,0, ЦеЛееообразно 6,0 — 6,5, и 1 М NaC1 в том же буфере. При этом отделяются окрашенные и другие примеси. Промытый сорбент переносят в хроматографическую колонку; Активный фермент элюируют 25%:ным изопропанолом в 1 М раствора NaC1, рН 7,0. Получают субтилизин с удельной активностью 2,5. Выход по активности 86%.

Формула изобретения

1. Способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции растворенных ферментов на,нерастворимом носителе — производном агарозы, активированном бромцианом и ковалентно связанном с лигандом, с последующим элюированием сорбированных ферментов солевыми буферами, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, в качестве носителя используют биоспецифический сорбент бацитрацинсефарозу 4В, содержащий в качестве лиганда антибиотик бацитрацин.

2. Способ по п, 1, отличающийся тем, что элюирование фермента производят с помощью органических растворителей на солевых буферах.

5 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийсяя тем, что карбоксильные протеиназы сорбнруются на носителе при рН исходного раствора 1,8 — 5,6, а элюируются при использовании буфера с рН 5,0.

10 4. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что сериновые протеиназы, например субтилизин, сорбируются на .носителе при рН исходного раствора 6 — 7,5, а элюируются при использовании буфера рН 7 — 7,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 551339, кл, С 07G 7/00, 09.09.75.

2. Патент США № 3904478, кл, 195-63, опубл, 09,09.75, 3. Степанов В. М., Лавренова Г. И., Адли К., Гончар М, В,, Баландина Г. Н,, Славинская М. М., Стронгин А. Я. Биоспецйфи25 ческая хроматография химозина. «Биохимия», 1976, т. 41, вып. 2, 294 (прототип).