Штамм 85-продуцент -аспарагиновой кислоты

Штамм 85-продуцент -аспарагиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С Л Н И Е 6448 ЗЗ

ИЗОБРЕТ Ен И Я

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ьоюз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 26.11.76 (21) 2423976/28-13 с присоединением заявки _#_ (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.01.79. Бюллетень Хе 4 (45) Дата опубликования описания 30.01.79 (51) M. Кл.

С 12К 1/02

С 12D 13/06

Государственный комитет (53) УДК 663.131:576. .8 (088.8) по делам изобретений и открытий

" .м мав

Е. H. Кондратьева, Н. С. Егоров, И. В. Берези, ..-,(",",..-.;у-,,.; „-, Е. Н. Красильникова, В. И. Яковле И В М ф

Московский ордена Ленина и ордена Тр государственный университет им (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) ШТАММ ESCHERICHIA COLI 85 — ПРОДУЦЕНТ

Ь-АСПАРАГИ НОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, продуцирующего L-аспарагиновую кислоту.

Одним из методов получения аспарагиновой кислоты является использование бактериального фермента — аспартазы, либо целых клеток бактерий, содержащих тот же фермент.

Известен штамм бактерий Escherichia 1p

coli АТСС 11303, продуцирующий аспарагиновую кислоту,(1).

Этот штамм инкубируют глубинным способом на среде, содержащей в 1 л: 30 г фумарата аммония, 2 r КзНРО4, 0,5 r MgSO4 1з

° 7Н20, 0,5 г СаСОз и 40 г кукурузного экстракта (рН среды 7,0) в течение 24 час при

37 С.

Об аспартазной активности целых бактериальных клеток, предварительно отделенных от среды, судят общепринятым способом по образованию аспарагиновой кислоты из фумарата аммония биологическим методом с использованием Leuconostoc mesentегоides P-60 и спектрофотометрически по потреблению фумарата. Ферментативную активность выражают в микромолях (мкМ) аспарагиновой кислоты, синтезированной за 1 час целыми клетками бактерий.

Удельная аспартазная активность нативных 30

2 клеток Е. coli АТСС 11303 при росте на указанной среде составляла 1,81 мкМ аспарагиновой кислоты за 1 час на 1 мг белка.

Недостатками известного штамма являются:

1) сравнительно длительный цикл развития штамма (24 час), что ведет к повышению стоимости целевого продукта;

2) штамм развивается на среде с кукурузным экстрактом, что связано со сложностями отделения бактериальных клеток от осадка экстракта и увеличивает стоимость целевого продукта;

3) сравнительно низкая аспартазная активность на указанной среде — 1,81 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за

1 час.

Цель изобретения — получение нового штамма бактерий того же рода, синтезирующего на разных средах высокоактивный внутриклеточный фермент-аспартазу, отвечающего требованиям, предъявляемым к продуценту и обладающего коротким циклом выращивания (6 час), большим выходом целевого продукта, получаемого в виде чистого оптического изомера (1 -форма аспарагиновой кислоты, (а) о =+25,5 ), T. штамма, не обладающего рацемазной активностью.

Штамм

Среда с кукурузным экстрактом

МПБ

12,01 — 35,88

15,4 — 46,0

Нет данных

1,81

Г1редлагаемый штамм выбран из числа чистых культур микроорганизмов, выделенных из различных природных субстратов (почвы, воды) на мясо-пептонной агаризованной среде (МПА) с 0,5 /о лактозы и фуксином.

Штамм хранится в коллекции чистых культур микроорганизмов кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ за Ко 85.

Штамм имеет следующие морфологические и физиологическис признаки.

Клетки бактерий представляют собой грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами 0,5 — 1)(3 нм, капсул и спор не образуют. Факультативные анаэробы. Оптимальный рост наблюдается при температуре 30 — 37 С. Колонии на мясо-пептонном arape (МПА) — блестящие, беловатые, мелкозернистые, однотипные, диаметром 2 — 3 мм. Рост на мясо-пептонном бульоне (МПБ) обильный с сероватым оттенком, пленки не образуется. В 24-часовых культурах наблюдается образование индола. При рс, те:на молоке образует кис лотЬ1 и газ . Хорошо растет на картофельной среде в виде серовато-желтого налета, Культура обладает характерным фекаль- и ым запахом.

Биохимические признаки. Отношение к углеводам: разлагает с образованием кисЕ. cali штамм 85 (предложенный)

Е. cali АТСС 11303 (известный) Как видно из таблицы, предлагаемый штамм Е. coli 85 отличается от известного штамма Е. coli АТСС 11303 высокой аспартазной активностью.

Для получения настоящего штамма исследован ряд проб воды и образцы почв

СССР. Штамм выделен из почвы удобренного садового участка (станция Зеленоградская Ярославской железной дороги

Московской области), Пример 1. Односуточные клетки

Е. coli штамм 85 смывают с поверхности мясо-пептонного arapa (МПА — общеизвестная стандартная среда) 1 — 2 мл жидкой стерильной среды и с помощью стерильной пипетки переносят в посевную жидкую стерильную среду следующего состава (на

1 л): фумарат аммония 30 г, К НР04 2 r,,MgSO4 7Н20 0,5 г, СаСО> 0,5 г, кукуруз5

50 лоты и газа, но пе сероводорода, глюкозу, фруктозу, лактозу, галактозу, мальтозу, арабинозу, ксилозу. Проба с метиловым красным положительная. Ацетоин не образует. Отношение к другим органическим соединениям: использует в качестве источника углерода пируват, формиат, фумарат, глицерин. Не растет на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода лимонную кислоту и ее соли. Отношение к азотистым веществам: хорошо растет за счет аммонийного азота, пептона, урацила.

Азот мочевой кислоты нс использует. Нитраты восстанавливает до нитритов, Обладает каталазной активностью, При сравнении с известным штаммом

E. coli АТСС 11303 путем определения оощепринятым методом аспартазной активности при инкубации суспензии целых клеток бактерий с фумаратом аммония в течение

1 час, предлагаемый штамм образует много большее количество аспарагиновой кислоты.

Интенсивность развития и аспартазная активность у предлагаемого штамма выше, чем у известного, Количество аспарагиновой кислоты, образованной из фумарата аммония суспензиями целых клеток предлагаемого и известного штаммов, выросших на среде с кукурузным экстрактом, видна из приведенной таблицы.

Удельная активность аспартазы (мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка зз 1 час) ный экстракт 40 г. Культуру выращивают

10 — 12 час глубинным способом при температуре 30 — 35 С в качалочных колбах емкостью 750 мл (объем среды 50 мл). Затем посевной материал в количестве 2 — 3% вносят в стерильную среду того же состава и выращивают тем же способом в течение

6 час в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. По истечении указанного времени целые клетки Е. coli штамм 85 обладают аспартазной активностью, равной 12,01 — 35,88 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 час.

Клетки отделяют от среды с помощью проточной центрифуги С-44, промывают 3—

4 раза 0,01 М фосфатным буфером (рН

7,5) и определяют активность аспартазы известным методом инкубации суспензии целых клеток бактерий с фумаратом аммо644833

Составитель М. Ларина

Редактор Н. Грязнова Техред Н. Строганова Корректор 3. Тарасова

Заказ 572/2 Изд. № 124 Тираж 548 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раушская наб., д. $/5

Типография, пр.

Сапунова, 2 ь ния. Удельная аспартазная активность целых клеток Е. coli штамм 85 составляет от

12,01 до 35,88 мкМ аспарагиновой кислоты, образованной 1 мг белка за 1 час, Пример 2. Односуточные клетки Е. coli штамм 85, выросшие на МПА, суспендируют в 1 — 2 мл стерильной жидкой питательной среды, переносят стерильной пипеткой в жидкую посевную среду того же состава (мясо-пептонный бульон — 10

МПБ), культивируют глубинным способом при рН 7,0 в течение 10 — 12 час при 30—

35 С в качалочных колбах емкостью 750 мл (объем среды 50 мл). Затем посевной материал в количестве 2 — 3% вносят в среду то- 15 го же состава и выращивают бактерии в течение 6 час тем же способом в аналогичных качалочных колбах с объемом среды

125 мл. По истечении указанного времени аспартазная активность целых клеток 20

Е. coli штамм 85 составляет в разных опытах от 15,4 до 46,0 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 час.

Клетки отделяют от среды культивирования с помощью центрифугирования на проточной центрифуге С-44. Биомассу промывают 1 — 2 раза 0,01М фосфатным буфером рН 7,5 и определяют активность аспартазы общепринятым методом по количеству образованной аспарагиновой кислоты из фумарата аммония суспензией целых клеток бактерий. Удельная активность аспартазы 6-часовых целых клеток Е. coli штамм

85, выросших на мясо-пептонном бульоне, составляет от 15,4 до 46,0 мкМ аспарагиновой кислоты на 1 мг белка за 1 час.

Предлагаемый штамм по сравнению с известными штаммами имеет следующие преимущества: короткий период выращивания (6 час); хороший рост штамма на МПБ; 40 высокий выход целевого продукта; образование целевого продукта в виде чистого оптического L-изомера аспарагиновой кислоты (а) =+25,5, т. е. отсутствие рацемазной активности. 45

Формула изобретения

Штамм Escherichia coli 85 — продуцент

L-аспарагиновой кислоты. Хранится в коллекции чистых культур кафедры микробио- 50 логии биологического факультета МГУ.

Морфологические признаки.

Клетки — грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами размером 0,5 — 1)(3 нм, капсул и спор не образуют.

Физиологические признаки.

Мясо-пептонная агаровая среда. Рост хороший, колонии блестящие, беловатые, мелкозернистые, однотипные, диаметром 2—

3 мм. При добавлении к среде фуксина колонии приобретают характерный металлический блеск. Обладает фекальным запахом. Мясо-пептонный бульон. Рост обильный. Клетки с сероватым оттенком, пленок не образуют. Среда не окрашена. Образует и ндал.

Молоко. При росте на молоке образует кислоты и газ.

Картофельная среда. Рост хороший. Колонии серовато-желтого цвета.

Биохимические признаки.

Отношение к углеводам: разлагает с образованием кислоты и газа глюкозу, фруктозу, лактозу, галактозу, мальтозу, арабинозу, ксилозу.

Отношение к источникам углерода.

Использует пируват, формиат, фумарат, глицерин.

Не растет на лимонной кислоте и ее солях.

Проба с метиловым красным положительная. Ацетоин не образует.

Отношение к источникам азота. Усваивает соли аммония, пептон, урацил. Нитраты восстанавливает до »итритов.

На мочевой кислоте рост отсутствует.

Факультативный анаэроб. Оптимальный рост наблюдается при 30 — 37 С. Выход аспарагиновой кислоты из фумарата аммония суспензиями 6-часовых целых клеток бактерий, выросших на среде с кукурузным экстрактом, составляет 12,01 — 35,88 мкМ/мг белка/час, на МПБ — 15,4 — 46,0 мкМ/мг белка/час.

Продукт обладает высокой степенью оптической чистоты, является 1-изомером аспарагиновой кислоты (n) o = +25 5

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции 2158300, кл. С 12D

13/00, 1973.