Способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентраций

Способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентраций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП И Н- ИЕ («)646763

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлена 280273 (21) 1904844/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (51)М. Кл.

С 12 К 1/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 576. 809.. 36 (088. 8) Опубликовано 150879 Бюллетень ¹ 30

Дата опубликования описания 150879 (72) Авторы изобретения

Н. И. Передереев и В. A. Пухов

Всесоюзный научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИХ КОНЦЕНТРАЦИИ

Настоящее изобретение относится микробиологии и может быть использовано при определении концентрации микроорганизмов в ветеринарии и медицине.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентрации, заключающийся в том, что пробу микроорганизмов инокулируют в лактозный бульон, содержащий С -замещеннуюлактозу, и подвергают инкубированию в течение определенного времени при 37 С tll.

Бактерии в процессе роста расщепляют радиоактивную лактоэу выделяющийся радиоактивный С 4 0> адсорбируется гидроокисью бария с образованием при этом радиоактивного

ВаС ОЭ. Уровень радиоактивности выделенной культурой микроорганизмов по отношению ко времени является величиной прямо пропорциональной числу микробных клеток в пробе.

Для того чтобы определить количество живых бактерий по такому способу требуются специальные приспособления, обеспечивающие наиболее полное улавливание высвобождающегося в процессе расщепления лактозы

С 0, что сопряжено с потерей С О и неизбежным искажением результатов исследований.

Культивирование микроорганизмов по этому способу производят при

37 .С, что чревато опасностью роста банальйой .микрофлоры (стрептококки, стафилококки, грибки и др.). При анализе молока и молочных продуктов в пробе могут оказаться и патогенные микроорганизмы (бруцеллы, возбудители паратифа и др.), которые также активно расщепляют лактозу.

В связи с этим конечный результат измерения радиоактивности С 4 Ох не может быть отнесен к определенйому виду бактерий; Следовательно, получаемый резулЬтат не позволяет судить о точном количестве клеток в исследуемом образце.

С целью упрощения процесса подготовки и повышения точности определения концентрации нативных микроорганизмов инкубирование проводят с радиоактивным изотопом Р взятым в виде двуэамещенного фосфата натрия, при 2-8 С, в течение 18-24 ч, после чего клетки микроорганизмов отделяют от- супернатайта.

64676

Формула изобретения з 3

В основе изобретения лежит способность живых клеток активно-ассимилировать вещества, необходимые для их жизнедеятельности, в отличие от мертвых, накапливающих химические соединения только по законам сорбции и диффузии. Это позволяет 5 проводить измерение радиактивности непосредственно в клетках при включении радиоактивного изотопа после инкубации. их с меченым соединением.

Указанное обстоятельство упрощает 10 процесс и повышает точность опредеделения. Определение концентрации микроорганизмов заключается в из-мерении радиактивности нативных и термоинактивированных микроорганиз- f5 мов, причем инкубирование нативной пробы с радиоактивным изотопом проводят при 2-84С в течение 18-24 ч

-" а инактивированной — при той же температуре не менее 2 ч. В качестве радиоактивного изотопа используют ь2

P в виде двузамещеннбго фосфорнокислого натрия. С помощью калибровочной кривой по уровню активности

Ъ1

P, коТорый включается в клетки при ассимиляции, находят концентрацию живых микроорганизмов.

Характерно отметить, что концентрацию живых бактерий в исследуемом препарате можно определить в течение суток, что в несколько раз быстрее бактериологического метода высева культуры в чашки с. агаром.

На фиг. 1 показана зависимость интенсивности ассимиляции и сорбции изотопа соотвественно нативными и термоинактивированными клетками р» исе Ес» abortus (шт. 19) от удельной активности P при инкубацни в интервале 0,25-4 мккюри/мл (концен трация бруцелл составляет 200 млрд 40

Микробных тел/мл); на фиг. 2 - зависимость количества радиоактивного изотопа, связавшегося при ассимиляции живыми и при сорбции мертвыми клетками, от концент»рации бруцелл. 45

Как видно из фиг. 1 интенсивность ассимиляции изотопа P живыми бруцеллами (1) в несколько раз превышает сорбцию его мертвыми клетками (2).

Скорость счета Р 2 от нативных бруцелл пропорционально возрастает при

50 увеличении концентрации (Я„ ).

Активность сорбированного изотопа также возрастает с увеличением.. концентрации термоинактивированных клеток (N2 ), но на порядок меньше (см. фиг. 2) . Обнаруженные закойомерностй .позволяют построить калибровочную кривую зависимости дй й, — й1 от концентрации живых микроорганизмов, где 60

9 и К2 соотвественно активность

Рз в нативной и термоинактивированной пробе.

Пример. Бакмассу с неизвестной концентрацией клеток стерильно разливают по 5 мл в две центрифужные пРобиРки. Одну из проб инактивиРУют нагреванием при 1 = + 100 С в течение 30 мин . К охлажденной пробе термоинактивированных клеток и к пробе с нативными клетками добавляют равиоактивный Dаствор двухзамещенного Фосфорнокислого натрия, так чтобы удельная активность Р 2 в пробах составляла 4 мккюри/мл.

Интактные и термоинактивированные клетки с радиоактивным иэотопом оставляют.на экспозицию при 2-8 С.

В этих температурных условиях не наблюдается роста и деления клеток.

Инкубирование нативных кЛеток с радиоизотопом проводят в течение 18-24 ч, так как количество Р

32 обнаруживаемое при ассимиляции живыми клетками, к этому времени достигает максимальных значений. Сорбция изотопа инактивированными клетками достигает максимума уже после двух часовой экспозиции.

После инкубации с изотопом клетки обеих проб четырехкратно отмывают центрифугированием в течение

20 мин на ЦУМ-1 при 4000 об/мин с последующим сливом супернатанта и ресуспенэированием осадка в 10 мл воды.

Отмытые клетки разводят до исходной концентрации, добавляя 5 мл воды, суспендируют и используют для анализа. Из каждой пробы берут по 1 мл суспенэии клеток трехкратно.

Образцы помещают на мишени-подложки, высушивают и измеряют активность изотопа PS на радиометрической ус- . тановке типа Б-2 с торцовым счетчиком типа Т-25-БФЛ (или на жидкостном сцинтилляционном спектрометре типа ABAC БЬ-40 без высушивания образцов) в нативной N и термоинактивированной Я2 пробах. По значению

М -К2 с помощью калибровочной кривойдй (см. фиг." 2) определяют концентрацию живых микроорганизмов.

Способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентрации в пробе, включающий инкубирование микроорганизмов с радиоактивнйм иэотопом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса подготовки и повышения точности определения концентрации нативных микроорганизмов, инкубирование проводят с радиоактивным иэотопом P взятым в виде двуэамещенного фасфата натрия, при

2-8 С в течение 18-24 ч, после чего клетки микроорганизмов отделяют от суспернатанта.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 9 2.914.447, кл. 195-103 ° 5, 1959.

646763

1 25 о 50

) 2,5 Е ф

О5 1 г

Удельная ангпионосгпь и, гглкюрн ил

Я2

Рог.1

1 z5 к

Ф

S0

0 о0 Ж7 120 1И дц

Концентрация ликроорганизюб, кяед/ля

Ри z

Составитель И. Насоповский Pe акто Т. Коло ева Тек Э.ЧУжик Ко екто E. ЛУкач

Заказ 4827/60 Тираж 526 . Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР

9<2 делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра ская наб. 4 5.

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4