648117 - Способ получения антибактериального вещества

Способ получения антибактериального вещества

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Свюа Северских

Социалистическими

Респубпнй (61) Дополнительный к патенту2 (51) М. Кл.

С 12 D 13/00 (22) ЗаявлЕно 18, 04. 75.(21) 2129801/28-13 (23) Приоритет вЂ” (32) 20. 04. 74

Государственмый ком итет

СССР яо делам нзобретейий к открытий

{33) Великобритания (31) 17410/74 (53) УДК615. 779.

° . 931 (088. 8) (43) Опубликовано 150279. Бюллетень №6 (45} Дата опубликования описания 2002,79

Иностранцы

Мартин Коул,. Томас Трефор Говарт и Кристофер Ридинг (Великобритания) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Бичам груп Лимитед (Велик.обритан ия) .(71) Заявитель (54), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО

ВЕМА CTBA

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения антибактериального вещества.

Предложенное антибактериальное вещество является новым и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение аитибактериального вещества: формулы

Эта цель достигается тем, что штамм

ЫгерФовпсеь с(сзчобде ы

ATCC . 27064 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующей экстракцией целевого продукта из подкисленной среды органическим растворителем, не смешивающимся с водой, и очисткой и при необходимости переводят в соль .

Кроме того„ экстракцию осуществляют Н-бутиловым спиртом.

Штамм Streptom ces clavut1 ms

АТСС 27064 выращивают на питательной среде, содержащей комплексный органический источник азота в количестве

0,1-10%, такой как дрожжевой экстракт жидкость для замачивания зерна, растительный белок, семенной протеин, гидролизаты белков, гидролиэаты молочного белка, рыбный и мясной экстракты, пептоны, в качестве источников азота могут быть также использованы мочевина, смесь аминокислот, таких как валин, аспарагин, глутаминовая кислота, пролин и фенилаланин.

Углевод в количестве 0,1-5% может быть включен в питательную среду, однако присутствие глюкозы в некоторых средах является нежелательным, так как она оказывает подавляющее действие на выход антибактериальногО вещества.

Можно также применять крахмал или гидролизаты крахмала, такие как декстрин, сахароза, лактоза или другие сахара, а также глицерин или эфиры глицерина. Источник углерода может быть выбран из растительных масел или животных жиров. Карбоновые кислоты и их соли могут использоваться

s качестве источника углеродадпя роста и получения р -лактамаэных ингибиторов. Предпочтительная дешевая

3 648117 среда представляет собой смесь соевой муки (Arkaso> ), высу-, шенных растворимых на основе винокуренного солода (ScotasoL ) и декстрина.

Добавление пеноудаляющих агентов, таких как Р1цгоп(с L 81 может быть необходимым для контролирования пенорбраэования некоторых сред в ферментаторах. l

В среды можно добавлять минеральные соли, такие как NaCC, КС, ИдСЮ, 10

2н СС, FBCLg На 04, Ге Ю4, NgSO4, а также натриевые и калиевые соли фосфорной кислоты,. СаСО можно добад ять в качестве источника ионов

Са, в качестве микроэлементов, 15 таких как никель, кобальт или марганец можно добавлять их соли. По же1 ланию в смесь могут быть добавлены витамины.

Культивирование Ыгер1огпзсе s сСа чо8(дегиэ проводят при 15-40 С,обычно при 20-35 С и при рН 5-8,5, предпочтительно 6-7,5.

Streptomsces cLavuLiger культивируют в среде в стеклянных конических колбах, которые продува ют воздухом в результате встряхивания на ротационном аппаратедля встряхивания или в ферментаторе из нержавеющей стали с отбойными перегородками при перемешивании с помощью

3о турбинной мешалки с лопастными дисками и при аэрации с помощью разбрызгивания. Ферментацию можно также осуществлять непрерывным способом.

Начальный рН ферментации обычно 35 составляет 7,0 и максимальный выход антибактериального вещества (клавулановой кислоты) получают за 2-10 дней при 20-35 С.

Клавулановую кислоту экстрагируют 40 из фильтрата различными способами.

Экстракцию с помощью растворителя из холодного экстракта культурй, в которой рН регулируется так, чтобы иметь значения в кислой области шкалы, проводят на анионообменных смолах. Клетки Streptomsces cLavuL

Для экстракции используют растворитель, фильтрат культуры охлаждают и рН понижают до 2-3 в результате добавления кислоты при интенсивном перемешивании с несмешивающимся с во- 55 дой органическим растворителем, таким как н - бутилацетат, метилизобутилкетон, н-бутанол или этилацетат.

Кислота, которая используется для понижения рН среды, обычно представ-- 60 ляет собой минеральную кислоту, такую как хлористоводородная, серная, азотная, фосфорная. н-Бутанол является наиболее применимым растворителем для использования при экстракции подкисленного фильтрата культуры. После разделения фаз в результате центрифугирования Р -лактамаэаингибирующий метаболит экстрагируется из фазы растворителя в водный раствор бикарбоната натрия или вторичный кислый фосфат калия (бу- . фер), суспензию СаСО или воду, при этом рН поддерживается практически на нейтральном уровне, например равным

7,0. Этот водный экстракт после раз-, деления фаз может быть сконцентрирован при пониженном давлении и высушен на холоду с образованием сырого продукта, представляющего собой соль клавулановой кислоты. такой продукт является устойчивым при хранении в сухом твердом состоянии при -20 С.

Иожно использовать еще один экстракционный способ, который заключается в контактированиифильтрата культуры (обычно при нейтральном рН), содержащего соль клавулановой кислоты, с органической фазой, в которой растворяется нерастворимый в воде амин. Подходящие для этих целей растворнтели включают такие несмешивающиеся с водой полярные растворители, как метилизобутилкетон, трихлорэтилен и т.п. Подходящие амины включают вторичные или третичные амины, в которых одна из замещающих групп представляет собой алифатичес- кую группу с длинной цепью, например, из 12-16 углеродных атомов, а другая группа представляет собой третич.ную арилалкильную группу, в результате чего молекула оказывается липофильной. Amber Lite L AL является наиболее пригодным амином. Как правило, амин используется как кислая соль присоединения.

После такого способа экстракции клавулановая кислота присутствует в органической фазе в виде соли амина.

Затем органическую фазу отделяют от фильтрата культуры. Клавулановая кислота может экстрагироваться обратно в водную фазу в результате обратной экстракции раствором соли, предпочтительно концентрированным раствором хлористого натрия, азотнокислого натрия и т.п. Сырая соль клавулано-) вой кислоты может быть затем получена в результате сушки на холоду.

Другие способы выделения, которые могут быть использованы, это адсорбция на угле, осаждение, высаливание и молекулярная фильтрация, однако они обычно оказываются не эффективными.

Дальнейшую очистку сырых твердых веществ можно осуществлять многими спбсобами, однако ионо-обменная колонная-хроматография представляет собой очень эффективный способ, особенно при использовании 3sopor de AciЕйе F F 1 Ð SF A 64 или DE A E целлюлозы, колонка с De Ас1011е

648117

Фракции, содержащие вещество, которое ингибирует р -лактамазу, вы рабатываемую Е эсене ichia co(!, смешивают, выпаривают досуха в вакууме, повторно растворяют в воде и сушат на холоду с образованием соли клавулановой кислоты в виде белого твердого вещества.

Способы, которые являются наиболее эффективными при детектировании клавулановой кислоты в фильтратах культуры, представляют собой бумажную хроматографию и биоаутографичеСкую детекционную систему. Тонкослойная хроматография может испольэоваться для определения клавулановой кислоты в твердых препаратах.

Способ получения клавулановой кислоты Или ее соли в числом виде включает выделение загрязненной формы клавулановой кислоты или ее солей, образование эфира клавулановой кислоты согласно известной методике,очист50 ку эфира .и дальнейшую регенерацию клавулановой кислоты или ее соли из эфира.

)4ожет представлять собой градиент, который элюирует водным раствором соли, такой как например хлористый натрий (О - 0,5 моль) . Колонку с DEAE целлюлозой в фосфатном буфере (0,01 М) при рН 7 можно Злюировать раствором соли; обычно раствором цаСГ (0,02 M) з в фосфатном буфере (0,01 M) при рН 7.

Активные фракции можно детектировать по их Р -лактамазаингибирующей активносТи и их антибактерицидной активности и отношении KCebsiefha аегogeses 10 в результате проведения испытания на диффузионном агаре. Фракции, содержащие основную массу с такой активностью, затем объединяют и концентрируют до небольшого объема в вакууме. 15

Сырой препарат соли клавулановой кислоты затем обессоливают путем пропускания через адсорбирующий слой В(о . 0el Р 2. Активный обессоленный материал концентрируют, смешивают с этанолом и подвергают дополнительному хроматографированию на колонке с целлюлозой с использованием в качестве растворителя верхней фазы бута/ нол вЂ” этанол - вода в соотношении

4:1:5;

Загрязненная клавулановая кислота или ее соли обычно содержат до 1 sect антибиотика.

Пример 1. 5tr eptoinwces c ovо(1qe.гu культивируют при 26 "С на срезах агара, содержащих 1 вес.% дрожжевого экстракта, 1 вес. t глюкозы и 2 вес. В оксоидного агара 93 рН 6,8. Для переноса мицелия и спор со среза в 100 мл жидкой среды, находящейся в эрленмейеровских колбах на 500мл используют стерильную лопатку, Жидкая среда имеет следующий состав, г/л:

Солодовый экстракт 10

Б а к териологич еский пептон 10

Глицерин 20

Водопроводная вода Остальное

Среду поддерживают при рН 7,0 с помощью раствора гидроокиси натрия, разливают в колбы по 100 мл, которые закупоривают пластиковыми пробками перед тем на 20 мин. Инокулированную засеянную колбу встряхивают в тече.ние 3 дней при 26 С на ротациоиной трясучке со скоростью порядка 240 об/мин. Колбы для получения, содержащие жидкую среду, инокулируют

5 вес.% вегетативным прививочным материалом и прорастание осуществляют в тех же условиях,что и в колбе с посевом. Образцы фильтрата,культуры проверяют на ингибиторное действие против Р-лактамазы,.вырабатываемой Etcher 1сИ а cob Лт4.

Оптимальная активность достигается через 3 дня, Результаты представлены в табл. 1. Зона клавулановой кислоты Я 0,46 обнаруживается при иссëeäîsàíèè фильтрата культуры методом бумажкой хроматографии.

51.",ер tomsces c(!avuf1де и также повергают культивированию в двухлитровой колбе для встряхивания; содержащей 400 мл среды (стадия по-. лучения), при использовании такой же среды и условий культурирования; как описано выше. В этих более крупных сосудах рост организма происходит более медленно и оптимальная

-лактамазаингибирующая активность достигается через 7 - 9 дней инокуляции вегетативным прививочным материалом. Результаты также представлены в табл. 1.

648117

Таблица 1

9-Лактамазная ингибирующая активность разновидности

6treptomwces сСачобцегоз, растущей в колбах на

500. (Z ) и 2000 м Г11>, 1

9 м)

: Конечное разбавление фильтрата 1/2500 J

Пример 2. Культивирование

Ыгср отзсеь cXavuf дегus.

Колбу для посева; подготовленную согласно примеру 1, используют для инокулирования конических колб на

500 мл, содержащих 100 мл аликвоты описанной ниже среды в деионизиро ванной воде, вес.%1

Растворимый крахмал 2

Глицерин 0,3

Скотазол 0,1

Ai 1саьоч 1

ГезО4 .7Н О 0,01

Среду подвергают стерилизации в автоклаве в течение 20 мин и инокулируют путем добавления 5 вес.% вегетативного прививочного материала.

Колбы встряхивают при 26 С на ротационной трясучке, как описано в примере l. Оптимальйый титр клавулано,вой кислоты достигается к 3-5 дням.

Разбавление .фильтрата культуры в соотношении 1/2500 дает 60%-ное ингибирование в пробе на ингибированиа

Р -лактамазы. Зона клавулановой кислоты обнаруживалась при Rf 0,46 при использовании метода бумажной хроматографии. Эта зона увеличивает-, ся в размере параллельно с увеличением активности в пробе на определение иигибирования р -лактамазы.

Пример 3. Колбу для культуры посевного материала согласно примеру 1 используют для инокулирования конических колб на 500 мл, содержащ4х 100 мл аликвоты приведенной ниже среды, вес.%:

Декстрин 2

Аркасой 1

Скотазол 0,1

FeSO+ 7Н О 0,01 приготовленной в деиониэированной воде и стерилизованной.

Содержание прививочного материала составляет 5%.

Инокулированные колбы встряхивают при 26 С. Оптимальная р-лактамаэаингибирующая активность достигается за 3-5 дней. Эта активность ана35 логична активности в примере 2.

Пример 4. Культивирование

Stveptam>ceo сйavv8iger èü

Прививочную стадию, описанную в примере 1, используют для инокули40 рования конических колб .на 500 мл, содержащих следующую среду, приготовленную в деиониэированной воде, вес.%:

Декстроэа 1

45 CoeBRH мука 1

Скотаэол 0 05

СаСОЗ 1

Эти колбы обрабатывают точно таким же способом, как описано в предщест50 вующих примерах, и культивируют при идентичных условиях. 8-Лактамазаингибиторная активность достигается эа 3-5 дней. Фильтрат культуры при конечном разбавлении 1/2500 дает

35-45%-ное ингибирование в пробе на определение -лактамазаингибиторной активности.

Пример 5. Культивирование

5treptom ces cLavueiger -Лактамаэаингибиторную актив60 ность получают прн использовании приведенной ниже среды, вес.%;

Глицерин 1

Соевая мука 1,5

Мд604 0,1

К НРО„ 0,1

648117

25 при осуществлении стадии прививки в условиях культивирования аналогичных примеру 1.

Пример 6, Культивирование

5treptom c сСочнС(деглан.

Следующую среду используют для получения клавулановой кислоты при использовании таких же условий и вегетативного прививочного материала, что описаны в примере 1, нес.%:

Глюкоза 2

Lat3. LerIica 1 )0

Оксидный дрожжевой экстракт СаСО 0,3

Среду готовят в деионизированной воде.

Оптимальные титры достигают за 15

3-5 дней и разбавление фильтрата культуры в соотношении 1/2500 дает

35-45%-ное ингибирование в пробе на определение ингибирования f3-лактамазного энзима.. 20

fI р и м е р 1. Культиниронание

Streptorn ces ckavufiqегusАналогично примерам 4, 5 и б приведенная ниже среда, вес.%:

Глюкоза 2

Аркасой l

СаСО 0,02

СоС1 бН О 0,0001 дает 35-45%-ное ингибирование (разбавление l/2500) в р -лактамазной пробе при оПтимальном титре, который достигается, через 3-5 дней после инокулирования.

Пример 8. Культивирование

5treptom ce s с Санчо б(тего ь.

Описанная ниже среда для стадии получения, при ее использовании в стандартных условиях культивации, аналогичных описанным в предыдущих примерах дает 20-30%-ное ингибированяе при 1/2500 разбавлении н опыте 40 на (-лактамазу за 3-5 дней после инокуляции. При использовании метода бумажной хроматографии зона клавулановой кислоты . вЂ” Щ 0,46 при исследовании фильтрата культуры. 45

Среда, вес.%:

Скотазол 2

Оксоидный дрожжевой экстракт 1

Среду готовят в водопроводной воде, РН 7,0. .Пример 9 ° Культивирование

Stretto rnvce s с апач о й1дег о ь. йри стандартных условиях культивации при использовании приведенной ниже среды получают клавулановую кис55 лоту через 3-5 дней после инокулирования вегетативным прививочным материалом. Разбавление культуры н соотношении 1/2500 приводит к 20-30%ному ингибиронанию в пробе на инги- @ бирование р-лактамаэы.

Среда, г/л:

Глицерин 15

Сахароэа 20

Пролин 2,5

Мононатрий глутамат 1,5

)4 а С (5,0

HPO 2,0

Мпе, 4Н,О 0,1

0,1

ZnCC2 0,05

MgSO 7Н О 1,0

Среду готовят в деиониэированной воде РН 7,1.

Пример 10: Культивирование

54гeptîrïvcås ctavuPjger us.

Для получения посевного материала выращивают культуру на косом агаре в склянке Rou инкубацию проводят при 26 С в течение 10 дней.

После инкубации добавляют 100 мл стерильной воды и получают суспенэию мицелия, Эту суспензию используют для инокулирования 50 л стерилизованной прививочной среды следующего ниже состава в водопронодной воде, вес.%:

Оксоидный солодовый экстракт 1

Оксоидный бактериологический пептон 1

Глицерин 1

10% пеногаситель

P(!urorIic I 81 в соевом масле 0 05

Среду помещают а девяностолитровый ферментатор иэ нержавеющей стали и перемешивают с помощью лопастной, дисконой.или центробежной мешалки со скоростью 240 об/мин. Стерильный воздух подают со скоростью

50 л/мин и инкубацию проводят при

26 С.

Через 72 ч прививочный ферментатор используют для инокулиронания

150 л этой же среды, вводя ее стерильно в соотноше:;ни 5% (об./об.).

Эту среду на стадии получения помещают в трехсотлитровый стальной ферментатор,приводимый во вращение с помощью дискового центробежного смесителя при скорости вращения 210 об./

/мин. Стерильный воздух подают со скоростью 150 л/мин. Ферментацию проводят по 10 мл (10% РРигоп1с L 81 в соевом масле).Через определенные интервалы отбирают образцы для анализа на ингибирование р-лактамаэы..ферментатор разгружают через 4-5 дней при оптимальном уровне р-лактамаэной ингибиторной актйвности.

В табл, 2 представлена (3-лактаl манная ингибиторная активность образцов фильтрата культуры, взятых из. трехсотлитрового ферментатора, содержащего StreptorIIsces cfavuf icterus.

648117

Таблиц а 2

Р-Лактамаэная ингибиторная активность образцов фильтрата культуры, взятых иэ трехсотлитрового ферментатора. обе на ингиы при конечка 1/2500, В

1,0

1,5

2,0

2у5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

П p" и м е р 11. Культивация

Опыт проводят в принивочном ферментаторе точно таким же образом, как 30 опйсано в примере 10, при использо- вании той же среды.

Через 62 ч содержимое привиночного фермента гора, представляющее 5% 35 (об/об.) вегетативного прининочного материала, переносят в трехсотлитровый ферментатор йз нержавеющей стали, содержащий 150 л стерилизованной среды, при перемещейии с помощью дис- 40 коного центробежного смесителя при скорости вращения 210 об/мин, Стерильный нОздух подают со скоростью 150 о л/мий. Ферментацию проводят при 26 С, Антипейный агент при необходимости добавляют порциямй по 10 мл (10%

Рблоп с r 81 в соевом масле) .

Среда, используемая на стадии получения, представляет собой такую же бРеду, что и в примере 3 и в нее перед стерилиэацней добавляют 0,05%(об/ об.) антипенного агента, представляющего собой смесь 10% Р огоп1с Ь 81 и соевого масла.

5 -Лактамазная ингибирующая активность образцов ферментации анало- 65 гична образцам иэ примера 10 (см. табл. 2). Бумажнохроматографическое исследбвание обнаруживает зону клавулановой кислоты при Rf 0,46 при использовании ранее описанного биоав- @> тографического (синергетического) crioсоба, Размер зоны, соответствующей клавуланоной кислоте, увеличивается параллельно увеличению ингибирования р -лактамазы.

Пример 12. Культивирование

Mreptomyces c tavuCigerus.

100 мл стерильной воды добавляют к спорообразующей культуре, которая прорастает на агаре Hennery,ü в течение 10 дней при 26 С. Готовят суспензию мицелия и спор, которую используют для инокуляции 75 л стерилизованной среды следующего состава в водопроводной воде, вес.%:

Декстрин 2

Аркасой 1

10% PEurcrr c

Ь 81 в соевом масле О, 03 рН среды поддерживают при 7,0

Среду помещают н столитровый ферментатор, который приводится Во вращение дисковой центробежной мешалкой со скоростью вращения 140 об./мин.

Стериальный воздух подают со скоростью 75 л/мин и сосуд инкубируют в течение 72 ч при 26ОC.

Содержимое прививочного ферментатора используют для инокулирова- ния 1500 л стерилизованной среды следующего ниже состава в водопроводной воде, нес.Ъ:

Аркасой 50 1,5

Глицерин 1,0

КН Р04 0,1

10% PEuronic L 84 в соевом масле 0,2 рН среды поддерживают на уровне

7,0, Среду помещают в ферментатор на

2000 л, перемешиваемый двумя дискоными центробежными мешалками, при скорости вращения 106 об./мин.

Стерильный воздух подают со скоростью 1200 м/мин, 648117.Ю

При необходимости добавляют 25 мл антипенного агента 10% РСогоп(с L83 в соевом масле). Ферментацию проводят при 26 С в течение 3-5 дней н получают максимальный выход клавулановой кислоты, равный 200-300 мг/мл.

Пример 13. Культивирование

Ыгер1ощэсеэ c(. avueigerus, Прививочный материал получают В соответствии с описанным ранее способом при использовании среды, описанной в примере 3 (при поддержании рН среды на уровне 7,0). Его используют для инокулиравания конических колб на 500 мл, содержащих 100 мл аликвоты приведенной ниже среды, приготовленной в деианизированнай воде и стерилизованной. Количество прививачного материала составляет

5 вес.Ъ.

Среда, вес.Ъ: Prichem Р224 1

Аркасой 50 1,5

КН,РО4 0,1 рН среды поддерживают на уровне

7,0, Инокулированные колбы встряхивают при 26 С и оптимальную р -лактамаэаингибирующая активность достигается эа 3-5 дней. В результате получают клавулановую кислоту (300500 мг/мл), Пример 14. Выделение сырой натриевой соли клавулановой кислоты.

Созревшую культуральную жидкость, полученную согласно примеру 10, осветляют в результате непрерывного центрифугирования и мицелий отбрасывают ° Из 150 л ферментационной жидкости получают 120 л очищенной культуральной жидкости, Этот фильтрат дает 58%-ное ингибирование в пробе на ингибирование Р -лактамазы при разбавлении 1/2500. Фильтрат охлаждают до 5 С и прибавляют 40 л н-бутанола. Смесь перемешивают и добавля;". ют 25% Н> 504 до тех пор, пока не установится рН, равный 2. Подкисленную смесь перемешивают в течение еще 10 мин перед разделением фаз центрифугированием. Водную фазу отбрасывают. К н-бутанольному экстрак ту добавляют 0,5Ъ Norit 55K . угля и смесь перемешивают в течение 15мин.

Уголь после использования отбрасывают путем фильтрации с помощью дйатомовой земли в качестве фильтрующего средства. К н-бутанолу добавляют

1/4 объема деионизированнай воды и смесь перемешивают при добавлении

20%-ного раствора NaOH устанавливая рН 7,0. Фазы разделяют центрифугированием и н-бутанольную фазу отбрасывают, водную фазу концентрируют при пониженном давлении до

800 мл и затем сушат на холоде. В результате получают 35 г сырого препарата клавулановой кислоты. Этот твердый препарат хранят в сухом состоянии при -20 С перед предстоящей дополнительно очисткой.

Пример 15. Выделение сырой натриевой соли клавулановой кислоты.

Один литр фильтрата культуры, дающего 53%-ное ингибирование в пробе на ингибирование P-ëàêòàìàýû и полученного согласно методике, описанной s примере 12, перколируют через колонку. После фильтрата культуры пропускают 300 мл дистиллированной воды для промывки колонки, Элюированне активного Р -лактамаэнога ингибитара осуществляют 0,2 И раствором аС1. Собирают фракции (20 мл) и испытывают их при конечном разбавлении 1/2500 в опыте на ийгибирование Р --лактамазы. Активные фрак- ции объединяют и концентрируют в вакууме до объема, равного 20 мл. Раствор обессалквают путем гельочищающей хроматографии на каланке и элюируют 1В-ным раствором н-бутанола в воде.

Активные фракции объединяют,,хларистый натрий элюируют после клавула новой кислоты и определяют с помощью раствора нитрата серебра. Объ-". единенные активные фракции концентрируют и сушат на холоде.

Один литр фильтрата культуры после обработки дает 0,45 г сырого твердого препарата клавулановой кислоты, имеющей Ь;о О, 92 мг/мл.

Это твердое вещество хранят при

-20 С перед последующей очисткой.

Пример 16. Выделение сырой,натриевой соли клавуланавой кислоты.

Фильтрат культуры, содержащий

300.мг/мл клавулановой кислоты подкисляют„ экстрагируют н-бутанолом и клавулановую кислоту подвергают обратной экстракции в воду при нейтральном рН.

Охлажденный фнльтрат культуры закачивают в смеситель, через впускное отверстие которого добавляют

6 вес.Ъ азотной кислоты для установления рН на выходе йз смесителя 2,0+ 0,1. Подкисленный фильтрат пропускают со скоростью 4 л/мин через охлаждаемый гликолем пластинчатый теплообменник, поддерживая температуру

2-5 С, рН концентрируют в проточной ячейке перед пропусканием через трехсекционный противоточный сепаратор.

Охлажденную воду, насыщенную н-бутанолом, прокачивают со скорос тью 3 л/мин через противоточный сепаратор. Водный раствор, выходящий иэ противоточного сепаратора, отбрасывают. Выходящую воду удаляют иэ бутанольного потока, вытекающего из противаточного сепаратора с использованием делительной центрифуги для системы жидкость/жидкость, Бутанол собирают в сосуд из нержавеющей стали, снабженный рубашкой для охлаж16

648117

Сырые препараты клавулановой кислоты, полученные по методике, описанной в примере 15, бчищают методом 45 ионообменной хроматографии. 18 г ма териала, полученного согласно примеру 15, растворяют в 25 мл дистиллированной воды и пропускают через слой смолы в хлоридной форме. Колонку элюируют хлористым натрием, полученным .в результате подачи самотеком

0,.05M хлористого натрия в смесительный резервуар, содержащий 1 л дистилированной воды, который в свою очередь подают в хроматографическую колонку. 10 мл фракции собирают и

Р -лактамазаингибирующую активность проверяют при 1/2500 разбавлен:.и фракций, активность элюируют после основной полосы цвета между фракциями 24 и 30. активные фракции =обира,ют и концентрируют до объема 30 мл.

Этот раствор -обессоливают и элюируют 1%-ным раствором н-бутанола ,в воде. 65 дения, в котором его хранят при темо пературе около 5 С. Из этого сосуда, отбирают 40 л аликвоты и тщательно перемешивают с 2 л охлажденной воды (5 C) насыщенной н-бутанолом.

PH этой смеси устанавливают равным 6,8 + 0,1 с использованием 20 5 ного раствора гидроокиси натрия.

Эту водную смесь экстракта и бутанола подают в смесительную центрифу-гу для- cHcTBMbl жидкость/жидкость со скоростью 2 л/мин. Из 1800 л фильт- 10 рата культуры регенерируют 90 л вод- ной фазы, содержащей 39% клавулановой кислоты, присутствующей в фильтрате культуры. 15 л водного экстракта регулируют с помощью добавления

60 r хлористого натрия на 1 л таким образом, чтобы общее содержание твердых веществ составляло 2-3%, и сушат распылением.

Сухой продукт, общий вес которого составляет 1 кг, содержит 62Ъ клавулановой кислоты, присутствующей в сырье, идущем на переработку.

Оставшиеся 75 л водного экстракта концентрируют ультрафильтрацией. Водный экстракт хранят при +5 С, поддер живая содержание твердых веществ, равное 8%, и затем сушат распрыскиванием. Высушенный материал содержит 75% клавулановой кислоты, присутствующей в сырье поступающем на сушку распылением.

Общий высушенный распылением продукт иэ 90 л водного экстракта содержит 69,4 г клавулановой кислоты, что составляет 72% клавулановой кислоты иэ сырья, идущего на сушку

Распылением и 21% клавулановой кислоты, присутствующей в 1800 л фильтрата культуры.

Пример 17. Частичная очист- 40 ка сырой клавулановой кислоты.

20 мл фракции испытывают на содержание клавулановой кислоты.с использованием пробы на ингибирование j3-лактамазы. Фракции также наносят на бумажные полоски и опрыскивают реагентом ЕИгEich или трифенилтетразола.

Р -лактамазаингибирующая активность,коррелируется с розовыми или красными пятнами, полученными в результате действия этих реагентов.

Активные фракции собирают за исключением тех, которые содержат хлористый натрий и концентрируют в вакууме досуха. Такая методика дает 520 мг частично очищенной натриевой соли клавулановой кислоты.

Тонкослойная хроматография (силикагель) такой клавулановой кислоты дает следующие значения Rf . Верхняя фаза смеси н-бутанол: этанол:

:вода вЂ” 4:1:5, Rf = 0,37; н-бутанол:

:уксусная кислота : вода вЂ” 12:3:5, Rf = 0,44; изопропанол : вода вЂ” 7:3; и = 0,78, Зоны определяют в результате опрыскивания реагентом E Йг1 сп б-аминопенициллин, используемый в качестве метки и определяемый в результате опрыскивания этим же реаге..том дает следующие значения Rf 0Ä36Ä

0,39 и 0,77 соответственно.

II р и м е р 18. Частичная очистка натриевой соли клавулановой кислоты.

Фильтрат культуры, полученный согласно примеру 12, подвергают экстракции растворителем согласно методике, описанной в примере 14 с образованием твердого препарата, который дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии с использованием диэтиламиноэтилцеллюлозы. Это твердое вещество растворяют в 20 мл дистиллированной воды, пропускают через колонку, набитую В-52 целлюлозой, в которой заранее устанавливают рН 7,5 с помощью 0,01 М натрийфосфатного буфера. Колонку элюируют ИаС(.градиентом. О,l И МаСФ в U,01 M натрийфосфатном буфере при РН 7,5 подают в смеоительную камеру, содержащую 1 л 0,,01 М фосфатного буфера, при рН 7,5, которая в свою очередь связана с колонкой. Фракции собирают и,их испытывают на р -лактамазаингибирующую активность при разбавлении 1/2500. Эти фракции исследуют также на антибактериальную активность, объединяют, концентрируют и затем обессоливают на колонке с В1огад

В(оде.Е Р 2. Как было обнаружено с помощью методов бумажной и тонко-слойной хроматографии, эти фракции содержат клавулановую кислоту, Пример 19, Выдегениетвердой натриевой соли клавулановой кис лоты.

Частично очищенный твер !А препарат клавулановой кислоты (500 мг), 17

648117

Ыg Н2 685

5tapb lococcus aureus (Russo&)

Escberichia cori 3Т 4

Eschericbia c.oui В М

Ktebsiet(!a aегоgenes А

Pseudorrionas аегорпоза 1822 (Ц 1ас1ог)

Pseudomonas daE Reise

1,0

2,0

0,6

5,0

0 1 полученной согласно методике примера 17, загружают в колонку с микрокристаллической СС 31 целлюлозой. В качестве хроматографического растворителя используют верхнюю фазу смеси н-бутанол : этанол : вода в соотношении 4:1:5. Хроматографирование проводят при 4 С и 4 мл фракции собирают. Фракции испытывают на присутствие клавулановой кислоты путем нанесения на фильтровальную бумагу и опрыскивания реагентом EhrEic8 (ро- 10 зовое пятно) или триценилтетразолом (красное пятно). Делают пробы на иН;гибирование р -лактамазы при 1/2500 разбавлении. Активные фракции объ;единяют и сушат в вакууме на рота- 1я ционном испарителе. Твердое вещество

;растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды и сушат на холоду.

Получают белый твердый препарат натриевой соли клавулановой кислоты.

Пример 20. Выделение твердой натриевой соли клавулановой кис лоты.

Концентрированный экстракт, полученный в результате ультрафильтрации в примере 16, содержит 10 г клавулановой кислоты. Этот экстракт перколируют со скоростью 1 л/ч через колон.ку анионообменной смолой в хлоридной, Форме. Затем колонку промывают 2 л деионизированной воды перед злюиро30 ванием градиентом хлористого натрия.

Градиент создают пропусканием через резервуар, содержащий 4 л 1,4 И NaC1 через перемешиваемый резервуар, содержащий 4 л NaCl, который соединен с перемешиваемым резервуаром, содержащим 4 л деионизированной воды. Последний соединен с помощью насоса с колонкой ° Колонку элюируют со скоростью 2,5 мл/мг и 25 мл фракции со- 40 бирают. Фракции испытывают на ингибирование Я -лактамазы.

Активные фракции объединяют и выпаривают в вакууме досуха. Затем до. бавляют этанол (500 мл) и твердое ве- 45 щество отфильтровывают после интенсивного перемешивания. Затем зтанольный экстракт выпаривают в вакууме досуха на ротационном испарителе и повторно растворяют в деионизиро- ванной воде (40 мл). Затем его загружают в колонку, набитую Bjorad

%ogeK, Р2, элюируют 1%-ным раствором н-бутанола. Фракции собирают и испытывают на р-лактамазаингибирующую активность при конечном разбавлении 1/2500. Опыты по определению содержания хлористого натрий при разбавлении фракцией в состношении 1/25 осуществляют с использованием раствора нитрата серебра.

=)ти Фракции, содержащие клавулановую кислоту, свободную от хлористого натрия, объединяют, концентрируют путем выпаривания растворителя при пониженном давлении до 20 мл и затей сушат на холоде. В результате этого получают 4,8 г натриевой соли клавулановой кислоты.

Пример 21. Получение натриевой соли клавулановой кислоты.

- СО,Ка

Практически чистый бензилклавуланат в зтаноле, содержащем кислый углекислый натрий, гидрируют над 10%ным пеногасителем в течение 25 мин при комнатной температуре и атмосферном давлении. Катализатор отфильтровывают, промывают водой и этанолом, и объединенные фильтраты выпаривают при пониженном давлении при комнатной температуре.

Оставшееся полуввердое вещество растирают в порошок в присутствии ацетона, фильтруют и промывают эфиром с образованием натрийклавуланата.

Пример 22. Ингибирование р -лактамазы натриевой солью клавулановой,кислоты.

Клавулановая кислота прогрессивно и необратимо ингибирует 1 -лактамазу, вырабатываемую E sc8ericWia

В табл. 3 приведено ингибирование

-лактамазы клавулановой кислотой.

Таблица 3

117 20 ( ют над 10% (/267 мг) и бикарбонатом натрия (244 мг) в течение 25 мин при комнатной температуре и атмосферном давлении. Катализатор отфильтI ровывают, промывают водой и этанолом и объединенные фильтраты выпарива5 ют, а продукт кристаллизуют.

Предлагаемое вещество обладает широким спектром антибактериальной активности, что показано в табл. 4.

Таблица4

648

Антибактериальный спектр натриевой соли нлавулановой кислоты

7,5

) 500

125

31-62

КСеЬз(еИа аеrogenes

125

Prov1dentia stuar &.

500

При использовании совместно с пенициллином 5 в качестве субстрата, натриевой соли клавулановой кислоты против р -лактамаэы, вырабаты)ваемой Мапо. aureus (Ru sse607 составляет приблизительно 0,06 мг/мл.

Пример 23. Получение клавуланата натрия.

Бенэил клавуланат (840 мг) в этаноле (30 мл) и воде (5 мл) гидрируI

MaphsKococcus aureus (oxforc)h )

Staph tococcus aureus (КоььеИ)

Вас1И05 50Ы1(.1з

Ыгер1осoccus 1аесаС ъ

Ыгeptococcus p ogenes CN10

Escher ichia co(.i NCTC 10416

КееЬь еИа ox>tocum (п1егоЬас1ег aегоgenes T624

Entегоbacter cKoacae

Acinetobacter ап 1га1оь

5еггат.(а магcescens

Proteus гп гat)itis С977

Ргoteus чоСцтаг s Ж090

5абвюпЕИа twphimurium

ЬЪщ еИа Son пе

P seudomonas аегцдиюва А

Предлагаемое антибактериальное вещество (клавулановая кислота) может быть представлено структурной, Г

Полное химическое наименование клавулановой кислоты вЂ” 2 вЂ (2R, 5R )вЂ”

-3-()s -гидроксиэтиледен) -7-оксо-4-окса-1-аэабицикло (3,2,0) гептан-2-карбоновая кислота. Она способна ингибировать.рост штаммов разновидности StaphwCococвЂ”

cus чогеиь, обладает синергитическим действием в отношении антибактерицидйого эффекта ампициллина против (-лактамазапроизводящих, штаммов Kscherichia соус,K(åb6Ê0a аего енес и staphwfococcus aureus синергитическим действием в отношении антибактерицидного эффекта цефалоридина против ф -лактамаэапроиэводящих штаммов Proteus в гаЫСЙ и

Staphylococcus aureus.

Наиболее применимыми солями клавулановой кислоты являются например такие, как натриевая, калиевая, кальциевая, магниевая, алюминиевая, аммонийная и замещенные аммониевые соли, такие как триметиламмониевая, беизатин, прокаин, а также аналогичные соли, которые получают обычным способом при реакции с пенициллинами или цефалоспоринами.

Клавулановая кислота и ее соли обладают ценными терапевтическими свойствами и могут применяться для

á0 лечения инфекции у млекопитающих, включая человека, в различных формах, таких как таблетки, капсулы, кремы, сиропы (микстуры), суспензии, растворы, способные к повторному со65 ставлению порошки, а также стерильнйе

648117

Формула изобретения

1. Способ получения антибактериСоставитель С. Малютина

Редактор Л. Иовожилова Техред И . Асталсш Корректор Л. Веселовская

Заказ 363/58 Тираж 527 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 формы, пригодные для инъекции или вливания.

Предлагаемое вещество обладает широким спектром антибактериальной активности и может быть использовано для лечения инфекционных заболеваний. ального вещества формулы 0 1,и аи, .и .eo,и о т л и ч а ю щ и А с я тем, что штамм Streptomwces c6avuCigervs

ATCC 27064 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующей экстракцией целевого продукб та из подкисленной среды органическим растворителем, не смешивающимся с водой, и очисткой, и при необходимости переводят в соль.

1О 2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что экстракцию осуществляют н-бутиловым спиртом.

Способ получения антибактериального вещества

Патент 648117