Способ получения -аспарагиназы

Способ получения -аспарагиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН И Я

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 23.08.76 (21) 2399068 28-13 с присоединением заявки М— (23) Г1риоритет— (43) Опубликовано 28.02.79. Бюллетень ¹ 8 (45) Дата опубликования описания 06.04.79 (51) 1.Кл.- С 12 D! 3, 10

Гвсударствеииый комитет по делам изобретений и открытий

53) Д1, 577 15 663 1 (088.8) (72) Авторы ,изобретения

Р. К. Озолинь, П. П, 1ривинь, 3, В. Гсрцберг, Л. А. Макарова, Ю. О. Якобсон, Р. И. Гвоздяк, А. Н. Мешков и Г. И, Клейнер

Институт микробиологии им. А, Кирхенштейна (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АСПАРАГИНАЗЫ

0,5 — 1,5

0,3 — 0,5

0,3 — 0,6!

0,7 в 1,4

0,02 — 0,05

1,0 — 4,0

Остальное

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам получения фермента 1-аспарагиназы.

Фермент L-аспарагиназы обладает антплнмфомной и иммуносупрессорной активностью, что определяет его применение в медицине. L-аспарагиназа широко распространена в животных и растительных тканях, микроорганизмах, в том числе бактерий, Известен способ получения L-аспарагиназы путем аэробного глубинного культивирования культуры ErwiIIia caIotovora на п итательной среде, содержащей источник углерода, дрожжевой экстракт, сернокислый магний, двухзамещенный фосфорнокислый калий, однозамещенный фосфорнокислый калий, соль аммон ия и воду tl).

Недостатками известного способа являются высокая стоимость препарата, сравнительно низкие активность и выход Lаспарагиназы.

Целью .изобретения является интенсификация процесса, увеличение выхода фермента и расширение сырьевой базы.

Для достижения поставленной цели в качестве источника углерода используют пентозосодержащие гидролизаты растительных отходов с соотношением ксилозы и глюкозы 0,6: 1 — 7: 1, при этом последние перед введением в питательную среду очищают активированным углем и смолой, а затем в очищенный раствор добавляют окись кальция.

Окись кальция вводят до достижения рН очищенного раствора 6,8, а питательная среда имеет следующие соотношения компонентов, вес. pIp

Пентозосодержащий гпдролизат

Соль аммония

Однозамещенный фосфорнокислый калий

Двузамещенный фосфорнокислый калий

Сернокислый магний

Дрожжевой экстракт

Вода

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Питательную среду готовят на основе доступного и недорогостоящего сырья

25 пентозосодержащих гидролизатов растительных отходов, например гпдролпзатоп кукурузных кочерыжек, xëoïêîBîé шелухи. отходов лиственных деревьев, обрезков виноградной лозы, стеблей подсолнечника, 30 костры льна и конопли, сине-зеленых водо10 — 20% от максимального насыщения, температура 30 — 40 С (оптимум 37 С) .

Пеногас|пель — силикон ЭПО-40 или подсол

IIе гное масло — вводят в количестве 0,01% при необходимости.

В ходе ферментации контролируют рН, рО2, прирост биомассы, удельную активносr., /.-аспарагиназы. На 8 — 16 ч роста в условиях периодического культивирова.!H I получают биомассу Envinia carotovora

2(.3 со средней удельной активностью Ь-аспарагиназы 8 — 15 МЕ/мг сухого веса и выходом фермента 20 — 73 МЕ/пл среды.

По окончании ферментации биомассу

15 сепарируют для выделения фермента. Быделспнс /-аспарагпназы из клеток осуществ",ÿiîò одним из известных способов.

Пример 1. Посевной материал Erwinia carotovora в количестве 0,01% исполь20 зуют для засева колб емкостью 250 лл с

50 лл среды следующего состава, вес. %.

0,5

0,5

1,0 — 4,0

Остальное

0,3

Перед приготовлением среды гидролнзаты подвергают очистке с помогцыо активнрованного угля и смолы КУ-1 и усреднснн о до рН 6,8 окисью кальция.

Исходную культуру размножают на агаровых косяках, инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37" С.

Продуцент сохраняют на агаризованных (2% arapa) средах: МПА (мясо-пептонный агар) или дрожжевой среде с глутамипом (2 и 0,5% соответственно). Культуру хранят при комнатной температуре (+20 С), пересевают через каждые 3 месяца.

Для выращивания посевного материала применяют среду, по составу аналогичную составу ферментационной среды. При этом в качестве источника углерода используют

:7-кснлозу в количестве 1%. Использование посевного материала, проадаптированного

; основному источнику углерода пентозосодерхкащего сырья, обеспечивает интенсивпый рост продуцента в процессе ферментации без заметного лаг-периода. Продолжительность выращивания посевного материала 16 — 24 ч.

Для засева ферментационной среды используют 0,01% посевного материала (по сухому весу) .

Ферментацию осуществляют в фермcíтерах объемом 4 л с рабочим объемом ферментационпой жидкости 2 л. Среду стерилизуют 40 — 60 яин при 1 атль Условия ферментации: рН среды 6,8 — 7,0 поддерживают

5% NaOH, рОд поддерживают на уровне

0,7

0,02

1,0

Остальное.

Перед введением в среду гидролизат обрабатывают активированным углем и смолой КУ-1, усредняют до рН 6,8 окисью

40 кальция.

Условия культивирования; рН 6,8 — 7,0, в процессе ферментации не регулируется, температура 37 С, скорость качалки 220 об/иин, продолжительность выращивания

45 16 .. 13 конце ферментации получают биомассу с удельной активностью Е-аспарагиназы 8 МЕ/лг.

Пример 2. Посевной материал ЕгМnia carotovora в количестве 0,01 % исполь50 зуют для засева ферментеров емкостью

4 л с 2 л среды, содержащей компоненты пo примеру 1. В качестве источника углерода используioT гидролизат xëoïêoâoé шелухи (Ферганский химический завод фура55 новых соединений) в количестве 1,3% по ксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы

5,3: 1. Перед введением в среду гидролизат обрабатывают активированным углем и смолой КУ-1, усредняют до рН 6,8 окисью

6о кальция. Условия выращивания: рН среды

6,8 — 7,0, температура в процессе ферментации 37 С, аэрация на протяжении всего процесса; рО2, равное 10 — 20% от максимального насыщения. После 15 ч фермен65 тацин получают биомассу с удельной активрослей, смеси сине-зеленых водорослей с подсолнечной лузгой и др.

Пентозосодержащие гндролизаты растительных отходов представляют сложпыс смеси пентоз (ксилозы и арабинозы) и гексоз (глюкозы и рамнозы) . Соотношение ксилозы и глюкозы колсолется в пределах

06: 1 — 7: 1, оптимум 4: 1 — 7: 1.

Из неорганических солей используют фосфаты, соли магния и аммония. Источником аминного азота служит кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, гндролнзат

;»п; ВВК, гндролизаты белков и др.

Согласно изобретению, фермсн.ация ведется в питательной среде следующего состава, вес. /0

Пентозосодержащий гидролизат (по ксилозе) 0,5 — 1,5

Однозамещенный фосфорнокислый ам vioHHH 0,3- — 0,0

Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,3 — 0,6

Двузамещенный фосфорнокислый калий 0,7 — 1,4

Сернокислый магний 0,02 — 0,05

Дрожжевой экстракт (или другой источник аминного азота)

Вода

Гидролизат костры льна

И КОНОПЛИ (ПО КСИЛОЗЕ) (соотношение ксилозы и глюкозы 0,6: 1)

Однозамещенный фосфорнокислый аммоний

Одноза мощенный фосфорнокислый калий

Двузамещенный фосфорнокислый калий

Сернокислый магний

Дрожжевой экстракт

Вода

649746

0 ор,i ул и изобретения

Пентозосодержащий гидролизат

Соль аммония

Однозамещенный фосфорнокислый калий

Двузамещенный фосфорнокислый калий

Сернокислый магний

Дрожжевой экстракт

Вода

0,5 — 1,5

0,3 — 0,5

0,3 — 0,6

0,7 в 1,4

0,02 — 0,05

1,0 — 4,0

Остальное

Составитель Т. Серебренникова

Техред Н. Строганова Корректор И. Симкнна

Редактon Е. Дайн

3а аз 50/161 Изд. М 172 Тираж 543 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Я-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фнл, пред. «Патент» ность;о / -аснарапшазы 12,9 МЕ/лг сух. веса и выходом фермента 72,5 МЕ. игл среды.

Пример 3. Посевной материал Erxviша саго1о ога в количестве 0,01 р используют для засева ферментеров емкостью 4 л с 2 л среды, содержащей компоненты IIO примеру 1. В качестве источника углерода используют гидролизат кукурузных кочерыжек (Краснодарский химический комбинат) в количестве 1,1% по ксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы в гидролизате

3,8: 1. Перед введением в среду гидролизат обрабатывают аналоп1чно примеру 1. Условия выращивания: рН среды 6,8 — 7,0, температура в процессе ферментации 37= С, аэрация на протяжении всего процесса, рО, равное 10 — 20 /1 от максимального насыщения. После 15 l ферментацпи получают биомассу с удельной активностью

L-аспарагпназы 15,4 МЕ/лгг сух. веса н выходом ферме11та 73 МЕ/лл среды.

Пример 4. Биосинтез / -аспарагнназы производят на среде, содержащей в качестве источника углерода гидролнзат отходов лиственных деревьев в количестве 1в/о по ксилозе, соотношение ксилозы и глюкозы в гидролизате 7: 1. После 16 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью Е-аспарагиназы 12,8 МЕг яг сух. веса и выходом фермента 60 МЕ/лл среды.

Использование предлагаемого способа получения L-аспарагпназы на основе пентозосодержащих п,дролнзатов растительных отходов дает значительное повышение выхода фермента и значительное снижение себестоимости готового продукта, обоснованное разницей стоимости чистых сахаров (ксилоза — 25 рггб/кг) и сахаров гидролпзатов (0,15 — 0,25 рг/б/кг) .

1. Способ получения L -aciiapaniiraai путем a=-робного глубинного культивирования культуры Er vinia carotovora на питательной среде, содержащей источник углерода, дрожжевой экстракт, сернокнслый магний, двузамещенный фосфорнокнслый калий, однозамещенный фосфорнокнслый

10 калий, соль аммония и воду, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью интенсификации процесса, увеличения выхода фермента и расширения сырьевой базы, в качестве источника углерода используют пентозо15 содержащие гидролизаты растительных отходов с соотношением ксилозы и глюкозы

0,6: 1 — 7: 1, при этом последние перед введением в питательную среду очищают активированным углем и смолой, а затем в очи20 щеннь1й раствор добавляют о вись кальция.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что окись кальция вводят до достижения рН о шщенного раствора 6,8.

3. Способ по п. 1, отличающийся

25 тем, что питательная среда имеет следующие соотношения компонентов, исс. сз.

Источник информации, принятый во

40 внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР

¹ 438684 кл С 12 D 13/10 1973