Способ титрации овисных антигенов

Способ титрации овисных антигенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Ф< н ; ; .. ока.

f4 3». 5;У.м 4т;b Х

Союз Советских

Социапиетичееиих

{ (-,:. сп 9ойик

< и 651026

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 05.01.77 (21) 2442956/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 050379Бюллетень № 9

Дата опубликования описания 0703.79 (51) М. Кл.

С 12 К 1/00

Государственный комитет

ССС P по делам изобретений и открытий (53) УДК 576 ° 8.097 (088. 8) (72) Авторы

ИЗОбрЕтЕНИя У.Э. Ниязов, Л.И. Tpycosa u A.П. Простяков.(71) Заявитель

Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов (54) СПОСОБ ТИ1РАЦИИ ОВИСНЬ1Х АНТИГЕНОВ

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к способам титрации овисных антигенов, и может быть использовано в ветеринарной лабораторной практике при контроле специфичности и активности овисных антигенов.

Известен способ титрации овисных антигенов в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), включаю- 10 щий разведение и инактивацию сывороток, разведение антигенов, титрацию комплемента, выдерживание бактериологической и гемолитической системы в холодильнике при 0-4 С в тече- 15 о ние 16-18 ч, добавление оттитрованной дозы гемолитической системы, выдерживание в водяной бане при 37 С в течение 20 мин и учет реакции через 3-4,и 24 ч (1) и (2).

Недостатками описанного способа являются использование нестандартных сывороток, активность которых снижается в зависимости от срока хранения; невозможность концентрирования используемых сывороток до нужных значений; большое количество разведении сывороток; влияние неспецифических белков, содержащихся в сыворотках, на специфичность и чувствительность реакции, а следовательно, получение по этим сывороткам овисных антигенов различной активности.

Целью изобретения является повышение специфичности, чувствительности и упрощение реакции.

Указанная цель достигается тем, что в качестве антител используют лиофилизированный полиглобулин.

Полученйе полиглобулина. 500 мл неконсервированной овисной сыворотки, полученной от одного или нескольких животных, нагревают до 40-42 С, о измеряют рН и при необходимости доводят до 7,5-7,6 0,1 н. раствором

NaOH или НС8, затем помещают в предварительно прогретый стакан гомогенизатора, добавляют 1,5% порошкообразного риванола (2-этокси-6,9-диаминоакридинлактата) и гомогенизируют в течение 3 мин при 2-2,5 тыс.об/мин °

Полученную вспененную массу фильтруют через капроновую ткань. Фильтрат помещают в холодильник при T=4-7 С на 2-3 суток для отделения свободного риванола. Затем раствор профильтровывают через фильтровальную бумагу и в полученном прозрачном растворе определяют содержание белка коло651026 риметрическим методом с биуретовым реактивом, а также чистоту полученных фракций и нативность белка зональным электрофорезом на бумаге.

При этом чистота белковых фракций должна сос=авлять 95 5,0о, а содержание белка в растворе — 2-3%. Полученный раствор разливают в ампулы по 3 мл и высушивают лиофильно. Остаточная влажность должна быть не более 3Ъ. После высушивания полиглобулина определяют количество сухого 10 вещества в мг Ъ в 5-6 ампулах (или флаконах) и выводят средний вес в одной ампуле (флаконе). После сушки раствор полиглобулина должен иметь рН 7,2-7,4, чистоту белковых фрак- 15 ций 95,0+5,0%.

Пример. Способ титрации овисных антигенов с применением полиглобулиыа.

Компоненты, используемые для титрации овисных антигенов в РДСК: раствор полиглобулина, содержащий в

1 мл 100 мг сухого вещества; испытуемые антигены; физиологический раствор с рН 6,8-7,0; негативные сыворотки баранов; S-бруцеллезная сыворотка; овисный антиген с известной активностью и специфичностью в рабочем разведении (1:100); антиген бруцеллезный для РСК в рабочем разведении (1:100); комплемент сухой для

PCK активностью в бактериологической системе (в разведении 1:20), не ниже

0,31; сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента с титром не ниже 1:2000; 4%-ная взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе.

Перед постановкой реакции рабочий раствор полиглобулина и S-бруцеллезную сыворотку разводят физиологичес- 40 ким раствором 1:5 и 1:10, а две негативные сыворотки — в соотношении

1:5. Испытуемые антигены разводят физиологическим раствором до 1:3001:500 (до предельного титра) . Конт- 41 рольные овисный и бруцеллезный антигены разводят физиологическим раствором 1:100. Комплемент разводят физиологическим раствором 1:20-1:30 в зависимости от титра.

Гемолитическую систему готовят из равных объемов 4%-ной взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе (из осадка эритроцитов, промытого 2-3 раза на центрифуге) и разведения в четвертом титре гемолитической сыворотки.

Последовательность способа титрации овисных антигенов в РДСК показана в табл. 1. Титрация гемолитической системы и определение ее рабо- 60 чей дозы главного опыта представлены в табл. 2.

Полиглобулин, негативную и S-бруцеллезную сыворотки разливают в пробирки по 0,5 мл. 65

Для титрования гемолитической системы две негативные сыворотки разливают в 10 пробирок по 0,5 мл.

Полиглобулин и сыворотки, разлитые в пробирки, инактивируют в водяной бане при 64-65"C в течение 30 мин.

Испытуемый антиген разливают по

0,5 мл в пробирки с полиглобулином, негативной и S-бруцеллезной сыворотками .

Контрольный овисный антиген разливают по 0,5 мл в пробирки для титрования гемолитической системы и в контрольный ряд пробирок с полиглобулином, негативной и S-бруцеллезной сыворотками. Комплемент разливают во все пробирки по 0,5 мл.

Все пробирки главного опыта и гемолитической системы выдерживают

16-18 ч при 0-4 С и 20 мин при комнатной температуре.

Затем титруют гемолитическую систему для определения ее рабочей дозы. Оттитрованную дозу гемолитической системы разливают во все пробирки главного опыта и выдерживают в течение 20 мин в водяной бане при

37-38 С.

Результаты реакции учитывают дважды: через 3-4 ч и через 24 ч. Реакцию оценивают в процентах гемолиза эритроцитов.

Антиген считается специфичным, если в разведении 1:25 и выше с негативными сыворотками в разведении

1:5 и с S-бруцеллезной сывороткой в разведении 1:5 и 1:10 не вызывает задержки гемолиза.

Антиген не должен обладать антикомплементарными свойствами, т.е. в контроле без сыворотки не должен вызывать задержки гемолиза эритроцитов.

Титром овисного антигена считается наибольшее его разведение, дающее полную задержку гемолиза эритроцитов с разведениями полиглобулина

1:5 и 1:10. Овисный антиген при тнтрации на полиглобулине должен выпускаться с двойным-тройным запасом активности (1:200 — 1:300) и применяться в разведении 1:100 (рабочий титр).

При титрации антигена ставят следующий контроль:

1. Контроль антикомплементарных свойств полиглобулина и сывороток.

К 1,0 мл полиглобулина или сыворотки в разведении 1:5 добавляют 0,5 нн комплемента и рабочую дозу гемолитнческой системы. Результат — полный гемолиз.

2. Контроль антикомплементарних свойств антигенов. К 1,0 мл антигена в разведении 1:100 добавляют 0,5 ни комплемента и рабочую дозу гемолитической системы. Результат — пслный гемолиэ.

3. Контроль гемотоксичностн антмгенов. К 1,0 мл антигена добавляют

651026

Т а б л и ц а 1

Схема титрации овисного антигена

Компоненты реакции

Разведение антигена

1 1

400

Разведение полиглобулина/сыворотки/ 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 о

Водяная баня при 64-65 С в течение 30 мин

Испытуемый антиген

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Комплемент в разведении по титру

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Выдерживание 16-18 ч при 0-+ 4 С и 20 мин при комнатной температуре

Гемолитическая система в рабочем титре (см. схему титрации гемолитич. системы) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Водяная баня при 37-38 С в течение 20 мин

1,0

0,5 мл физиологического раствора и рабочую дозу гемолитической системы.

Результат — полная задержка гемолиза.

4. Контроль резистентности эритроцитов. К 1,5 мл физиологического раствора приливают рабочую дозу гемоли- 5 тической системы. Результат — полная задержка гемолиза.

Применение лиофилизированного IIoлиглобулина вместо овисных сывороток, используемых в РДСК, имеет следующие преимущества: а) реакция антиген-антитело проходит более быстро и специфично, так как создаются условия для прямой свя- }5 зи соответствующих детерминантных групп антигена и антитела; кроме того, значительно снижается роль неспецифических реакций; б) вместо двух овисных сывороток разной активности используется один компонент — стандартный полиглобулин; в) титрация антигена проводится в

1-2 разведениях полиглобулина вместо

12 разведений двух овисных сывороток; г) в связи с отсутствием в поли25 глобулине балластных белков, не обладающих иммуногенной активностью, обеспечивается высокая специфичность реакции (РДСК); д) благодаря применению полиглобулина вместо сывороток значительно повышается чувствительность реакции; е) полиглобулин можно сконцентрировать до требуемых значений, поэтому его активность можно рассчитывать по содержанию в нем сухого вещества в 1 мл раствора и тем самым его стандартизировать; ж) срок хранения лиофильно высушенного полиглобулина практически не ограничен при стабильном сохранении всех свойств; з) в отличие от овисных сывороток голиглобулин дополнительно контролируется по иммунохимическим и физиКо-õèìè÷åñêèì показателям (чистота иммуноактивного белка, содержание его, HBTHEHocTb и т.д.), т.е. для реакции применяется компонент с заведомо известными свойствами; и) при постановке РДСК сокращается время и расход материалов на проведение титрации антигена.

Титрация овисных антигенов различных серий с применением полиглобулина показала более высокую специфичность, чувствительность реакции и более простое осуществление способа, чем в случае применения двух овисных сывороток разной активности.

«, ° . » «4»» ..» .- ° .»

651026

Т а б л и ц а 2

Схема титрации гемолитической системы для реакции длительного связывания комплемента

Дозы компонентов (мл) в пробирках

Компоненты

Негативная с«-,коротка в разведении . ; 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Водяная баня при 64-65 С в течение 30 мин

Антиген в рабочем титре 0,5 0,5 0,5 0,5 0„5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Комплемент (в том же разведении, как для главн. опыта) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Выдерживание 16-18 ч при 0-+4 С и 20 мин при комнатной температуре

Гемолитическая система

0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

Водяная баня при 37-38 С в течение 20 мин пг пг пг пг пг чг чг чг зг

Общий титр гемолитической системы — 1,2 мл рабочий титр — 1,0 мл

0,2

Результат

Пà — полный гемолиз, Чà — частичный гемолиз, Зà — задержка гемолиза. Опыт проводится параллельно с двумя негативными сыворотками.

Примечание:

Формула изобретения

Составитель В. Радьков

Редактор Т. Орловская Техред И.Асталош КорректорО . Билак

Заказ 736/27

Тираж 527 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал IIIIII Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ титрации овисных антигенов в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), включающий разведение и инактивацию сывороток разведение антигенов, титрацию комплемента, выдерживание бактериологической и гемолитической системы в холодильнике при 0-+4"C в течение

l6-18 ч, добавление оттитрованной дозы гемолитической системы, выдерживание в водяной бане при 37 С в течение 20 мин и учет реакции через

3-4 и 24 ч, о т л и ч а ю щ и й

35 с я тем, что, с целью повышения специфичности,чувствительности и упрощения реакции,в качестве антител используют лиофилизированный полиглобулин.

40 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Временная инструкция по изготовлению и контролю овисного антигена для РДСК, ГУВ МСХ СССР, 1972.

2. Триленко П.A. Диагностика инфекционного эпидидимита баранов с помощью РДСК, Ветеринария, 1979, 9 8, с. 107-109.