Питательная среда для культивирования микроорганизмов

Питательная среда для культивирования микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Сеюз Саеетеима

Сецмавмстнчвсмик

Респубпий

{63) дополнительное к авт. свид-ву

{53) йт. Кя.

С 12 К 1/06

A 61 К 39/08 (22) ЗаЯвлеио17.1077 (31) 2531692/30-15 с присоединением заявки Ph— (23) Государстееноый аомнтет. СССР по делам изобретаемой и открытий

Приоритет

Опубликовано 15.0379. Бюллетень ph 10

{53) УДК576 ° 8.095. .3(088.8) Дата опубликования описания 150379

{72) Авторы азебретеиия

Ю.N.Ãoðåëîs и A.Ñ.Îðåøêèí

{73) Заявитель

Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт Восточного отделения ВАСХНИЛ (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, в частности к получению питательной

f среды для культивирования аназробных микроорганизмов при изготовлении биопрепаратов.

Известно, что анаэробные Микроорганизмы культивируются на питательных средах изготовленных на основе

Мартеновского бульона и бульона Хоттингера, ферментативных и кислотных гидролиэатах мяса, каэеина и печени.

Микроорганизмы CIastridium perfringens типа С и D при изготовлении поливалентной гидрокисьалюминиевой вакцины против брадэота, инфекционной эцтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят, а также прн изготовлении квасцовых концентрированных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, культивируются на известной мясо-каэеинопеченочной питательной среды (МПК), содержащей гидролиэаты мяса, казеи- на и печени, взятые в соотнош=нии

2:2:1 (ч) (1).

Изготовленные квасцовые концентрированные анатоксины на этой питательной среде обуславливают выработку антитоксина в сыворотке крови имЪ мунизированных овец в титре 0,10,76 AE/Më по типу С и 0,2-1,4 AE/ìë по типу D.

Недостатком известной питательной среды является слабая антигенная активность изготовленных на ней анатоксинов. Кроме того, большинство применяемых питательных сред готовится из первосортного обезжиренного мяс-, ного фарша и печени, которых необходимо 8-15 кг на 100 л среды. Технология иэготовления их предусматривает неполный гидролиз в течение 0,5-4 час или водные вытяжки — отвары компонентов, содержания которых в различных сериях питательных сред, приготовленных по одной пройиси, резко отличаются и во многом зависят от качества сырья. Недостатком сущест- вующих питательных сред является так. же отсутствие визуального контроля окончания процесса выращивания культуры. Это особенно необходимо при высоких температурных режимах ицкубирования Ct. регйг1пцепз 40-42 С.

Микроскопия культуры, активирование прототоксина и грубая титрация на белых мышах требуют времени дэ 1 час и 5-10 белых мышей на каждое определение. Такой способ определения сро652216 ка максимального накопления токсина в культуральной жидкости нередко приводит к перерастанию культуры, разложению токсина и потере иммуногенных свойств, так как оптимальное время выращивания при укаэанном режиме составляет 4-8 час. 5

Целью изобретения является полу- чение дешевой стабильной питательной среды, при культивировании на которой возможно постоянно получать культуральные жидкости, обладающие иммуно- Ю генными свойствами, а окончание процесса выращивания культуры контролировать визуально.

Для достижения этой цели в среду введены (г/л) дрояокевая вода 190- )5

210; пептон (сухой) 3,5-5,5; пшено

8,0-12,0; среда Эндо (сухая) 1,5-2,5; едки натр (до рН срецы 8,0-8,3)

l,0-1,5g гидролиэаты вываренного мясного фарша и казеина в равных сост- . 20 ношениях по аминному азоту (250 мгЪ) до l л.

Гидролизаты казеина и вываренного мясного 4а15!аа получают полным ферментативным гидролиэом в течение 510 дней. Дополнительно введены рос- товые вещеетва иэ дрожжей. Среда

Эндо имеет в своем составе гидролиэат китовой или рыбной муки,:лактоэу, сульфнт натрия, агар-агар и индикатор Фуксин, т.е. вещества, способст30 вующие хорошему росту, размножению и индикации микробов. Значительное содержанне белковых и амино-азотйстых веществ создает буферность и стабильность при культивировании. . 35.

Выращивание CE. регйг1пдепй нй . этой питательной среде позволяет визуально контролировать процесс инку-

" бирования, стабильно получать анатоксины, обладающие иммуногенными свой- 40 ствами, в 10-20 раз более высокими по сравнению с данными активности, предусмотренными ийструкцией. Сокращается расход белых мышей, снижается.на 30% себестоимость питатЕльной 45 среды, упрощается технологический процесс изготовления :препарата.

Пример. Для приготовления предлагаемой питательной среды сначала готовят гидролизаты из казенна и вываренного мясного фарша (продукты отхода после получения мясной .воды). Гидролиэаты готовят раздельна по следующей прописи: на 1 кг сухого каэеина (ГОСТ 1211-41) и 3 кг вываренного мясного фарша добавляют по 100-150 r панкреатина (ИРТУ-.42

95046-65), по 10 мл деминерализованной воды и 100-200 мл хлороформа.

Содержимое хорошо перемешивают, плотно закрывают {чтобы не улетучился 60 хлороФорм) и ведут гидролиэ при 3740 С 5-10 сут, периодически перемешивая 2-3 раза в сутки в первые три дня и однократно в последующие. В конце гидролиэа на дне образуется

4 рыхлый сероватый осадок. Аминный азот 360-600 мг%, пептон 1-2% в гидролизате мясного фарша и 4-8Ъ в гидролизате каэеина. Отстоявшуюся надосадочную жидкость декантируют, фильт руя через ватно-марлевый фильтр, определяют основные биохимические показатели и используют по мере надобности. Гидролиэаты пригодны к применению в течение года при хранении в герметически закрытой емкости при

10-) 5РС.

Дрожжевая вода готовится накануне или в день составления питательной среды: 20 r сухих пекарских дрожжей заливают:l л воды, кипятят

20 мин, отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый, бумажный фильтр или

Фильтрующие пластины ф .

Составление среды. Берут по 2 ч. гидролизатов казеина и вываренного, мясного фарша с аминным азотом

50 мгЪ и добавляют 1 ч. дрожжевой воды. Устанавливают рК 8,2-8,35 (1030%-ным раствором щелочи), определяют аминный азот, который должен составлять 210-230 мг% и пептон (1,52Ä5%) . Дбводят до кипения и разливают по емкостям, добавляя в эависимостй от объема 0,5Ъ сухого ферментативного Пептона, ГОСТ 13805-68 (если содержание его менее 3,5%), 0,2% сухой среды Эндо и 0,8-1Ъ йшена (промытого, можно в мешочках). Приготовленная среда стерилизируется автоклавированием пРи 115-120 С 35-45 мин.

После стерилизации среда приобретает малиново- красный цвет и имеет следующие показатели:

Общий азОт, мгЪ 420-570 тминный азот, мг%, 210-230

Остаточный азот, мг% 300-406

Белок, % 0,9-1,5

Пептон, % 1,5-3,5.

Триптофан, мг% 60-80

PrI 8,15-8,35 о

Готовую среду охлаждают до 3740 С и засевают матрицевой культурой. Культивирование проводят при

37-42 С до начала обесцвечивания срео ды (переход малиново-красного цвета в желтый). Рост приостанавливают охлаждением и доведением рЫ. индикатор среды фуксин, в процессе метаболизма микроорганизма способствует хорошему росту и делению клеток, увеличивая койцентрацию бактериальной массы в 2-2,5 раза по сравнению с бактериальной массой, полученной на известных питательных сре° 0 дах, при этом усиливаются и иммуногенные свойства изготовленных на ней антигенов.

Токсичность культуральной жидкости, проверенная на белых мышах при внут65221

Формула изобретения

190-210

3,5-5 5

8 0-12,0. Дрожжевая вода

Пептон

Пшено

Среда Эндо (сухая) . Едкий натр

Гидролйэаты мяса и казеина В соотношейии 1:1 по аминному азоту

1,5-2,5

1,0-1,5 до 1л.

Составитель A.Ìàêàðîâ

Техред Л.Алферова Корректор M.Pÿøõî

Редактор Е.Хорина

Заказ 985/27 Тираж 525 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г.Ужгород, ул.Проектная,4 ривенном введении, в среднем составляет 4000 ШМ/мл.

Активность анатоксина определяли по накоплению титра эпсилон антитоксина (АЕ/мл) в сыворотке крови вакцинированных овец и кроликов. Овец вакцинируют дважды с интервалом 20 5 дней в дозе по 5,0 мл, при этом после первой вакцинации образование антитоксина в сыворотке крови наблюдалось в титре 0,5-2,0 AK/ìë, после повторной вакцинации 3,3-8,0 и бо- )p лее AF/Më.

У кроликов, вакцинированных в дозе 2,0 и 3,0 мл с интервалом в 14 дней, средний титр антитоксина в сыворотке крови после повторной вакцинации составляет в среднем 2,1 AE/ìë.

Контролем служат анатоксины, изготовленные на известных питательных средах панкреатического перевара мяса (ппм), изготовлено 5 серий анатоксина типа D в количестве 39 л, на питательной среде МПК (мясо-печеночиоказеиновая) изготовлено 4 серии в количестве 26,5 л.

Изготовленные анатоксины на этих питательных средах обусловили выработку эпсилон антитоксина в сыворотке крови вакцинированйых овец после двукратной вакцинации в дозе по 5,0 мл соответственно в среднем в титре

0,4 и 1,5 АЕ/мл; у кроликоВ 0,2 и 30 . l,7 АЕ/мл .

Преимущество питательной среды в сравнении с питательной средой, приготовленной на основе. перевара Хоттингера, применяемой в настоящее 35 время биопромышленностью для выращивания СХ. perfringens типа" С и D при изготовлении поливалентной гидрокисьалюминиевой вакцины против брадзота, злОкачественного отека, инфекционной энтеротоксемии овец и дизентерии ягнят, было проверено при изготовлении квасцовых концентриб ф рованных анатоксинов против инфекционной энтеротоксемии овец, промышленным реакторным методом.

Предлагаемая питательная среда для культивйрования CI. perfringens типа С и 0 стабильна в изготовлении по биохимическим показателям по сравнению с известными питательными средами, повышает активйость изготовленных на ней препаратов, позволяет визуально контролировать процесс культивирования (по изменению цвета среды), упрощает технологию изготовления антигенов.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов, премущественно CIostridium perfringens типа С и

D, содержащая гидролиэаты мяса и казеина и пептон, о т л и ч а ю щ а я» .с я тем, "что, с целью повышения иммуногенных свойств клостридий, среда дополнительно содержит дрожжевую воду, едкий натр, пшено и среду Эндо при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Источники информации, принятые во вникание при экспертизе

1. Ургуев К.P. Ветерннарня, 93 1974, с. 4б-47.