Способ выделения гликозидаз

Способ выделения гликозидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Q Д И А-H Й Й <и)653265

ИЗОБРЕТЕН Ия

Союз Советских

Социалистических

Республик

\ (бц дополнительное к аит- с®ид- 3 а (5|р X. K .

С 07 G 7/02 (22) Заявлено 10.03.77 (2Ц 2461735/23-04 с присоединением эанвкн И (23} Приоритет

Г@в даратаваний канхтвт

СССР па делам кзвбрвтвнкй и аткрыткй

Опубликовано 25.03.79.Бюллетень Ж 11 (53) УДК 577.15. . 07 (08 8. 8) Дата опубликовании описания 28.03.79 (72) Авторы изобретении

А. А. Артюков и H. В. Молодцов

Тихоокеанский институт биоорганической химии.

Нальневосточного научного центра AH СССР (54) СПОСОБ ВЫЙЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗИДАЗ

Изобретение относится к способам выделения высокоочишенных ферментных препаратов, в частности к способам выделения гликозидаз из обьектов животного . происхождения. Получаемые описываемым способом препараты могут найти примене- 5 ние в пищевой и микробиологической промышленности, в лабораторной и медицинской практике, а также могут быть исполь -зованы в научных целях.

В настояшее время описано большое число способов выделения ферментов из ржзличных источников. Сравнительно новым является метод очистки, называемый гидрофобной хроматографией. Синтетические сорбенты для гидрофобной хроматогра- 1 фии получают алкилированием или арилирсванием гидрофильных полимеров, например агар озы (1), Принципы метода гидрофобной хроматот рафии основаны на различиях в силе гидрофобных взаимодействий между гидрофобным сорбентом, выделяемыми ферментами и применяемыми растворителями. Из

2 наиболее распространенных сорбентов для метода гидрофобной хроматографии белков и ферментов пригодны октилсефароза СЬ-4 В и фенилсефароза СЬ-4В, получаемые указанным методом.

Из ранее известных методов выделения гликозидаз наиболее близким к предлагаемому является способ выделения гликозидазы из пасты E,cori методом гидрофобной хроматографии на пропиламиноагаро(2) .

Указанный сорбент получают путем ковалентного присоединения пропиламина к бромцианактивированной сефарозе 4В, Адсорбцию лизата Е, сой обычно проводят в 0„01 М трис-ацетатном буфере, рН 7,1, содержашем 0,6 М хлористый натрий, 0,01 М хлористый магний, 0,01 M P

-меркаптоэтанол и 0,4 М сульфат аммо- ния, а элюцию ферментов с хроматографнческой колонки осушествляют линейным уменьшением концентрации сульфата аммо ния в том же буфере. Используя в качестве гидрофобного сорбента пропиламиноага

653265 розу, выделяют 5-кратно очищенную ф -, -галактоэидазу иэ экстракта E. соИ с выходом 60%.

Однако известный способ выделения и очистки гликозидаз методом гидрофобной хроматографии на пропипаминоагарозе не позволяет одновременно выделить полный набор гликозидаз из лизата E.со6 а дает возможность. получить только один представитель этого класса ферментов — P - 10

-галактозидазу. Выделенный препарат j3

-гапактоэидазы не является однородным, а содержит дополнительно два других белка, что снижает эффективность выделения и степень очистки. Кроме того, использу- >$ емый сорбент, пропиламиноагароза, не пригоден для многократного применения из-аа лабильности и -ацилзамещенной имидокарбонатной группы в присутствии сильных нуклеофипьных буферных систем, 2О использование которых необходимо дпя регенерации сорбента„, Целью изобретения является разработка нового способа выделения и очистки гликоэидаз методом гидрофобной хроматографии для одновременного получения полного набора этих. ферментов, повышения их ферментативной активности и чистоты.

Для достижения укаэанной цели гликозидазы выделяют из обьекта животного происхождения (печень морского молюска Acmaea pctBida ) с использованием в качестве избирательного гидрофобного сорбента 2-И -бензоиламидогептиламино-4-окси-симм-триазинипагарозы, П ослед35 нюю получают несложным четырехстадийным синтезом через активацию сефарозы

4В трихлортриазином. Высокая избирательность связывания и большое сродст4О во глнкозидаз к 2-И -бзнзиламидогептипамино-4-окси-симм-триазинипагарозе (10-15 мг ферментов на 1 мл сорбента/ позволяют методом гидрофобной хроматографии одновременно выделить полный

45 набор этих ферментов и осуществить их

30-кратную очистку непосредственно из экстракта тканей животного происхождения с выходом 62%.

5Î

Предлагаемый способ выделения гликозидаз методом гидрофобной хроматографии, позволяющий проводить одновременное выделение полного набора гликозидаз с высокой ферментативной активностью и чистотой, заключается в том, что экстракт ферментов из объекта животного происхождения {печень морского моллюска Аспоеа

РоИИа ) подвергают хроматографии на

2-И -бенэоипамипогептппамино-4-оксн-симм-триазинипагароэе.

Предпочтительно процесс выделения гпикозидаз из укаэанного объекта проводить следующим образом. Лдсорбцию гликозидаз на 2-И -бенэоипамидогептипамино-4-окси-симмтриаэинипагароэе ведут в 0,05 N фосфатном буфере, рН 4,0—

6,5, желательно рН 5, а эпюацию фермен.» тов с хроматографической колонки осуществляют с использованием 50%-ного раствора этиленгпиколя в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0, содержащего 1 N хпористый натрий. Органический растворитепь (этиленгликопь) и избыток хлористого натрия из препарата гпикозидаз уда-ляют гель-фильтрацией препарата на сефадексе -5 0.

Пример. Гидрофобная хроматография, 7 г сырой печени морского моллюска Ac ma ea рай Р|да гомогенизируют в

35 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 5,0.

Осадок центрифугируют при 6000 об/мин и отбрасывают. Надосадочную жидкость подкисляют разбавленной соляной кислотой. до рН 4,0 при 0,2-1,5 С, выдерживают о

10-15 мин при этой температуре и выпавшие белки удаляют центрифугированием.

Полученные 30 мл экстракта гликоэидаз (107 мг ферментов с удельной активностью 0,34 ед/мг по и -нитрофенип-Н-ацетил-P-D -гпюкозаминиду) доводят до рН 5,0 и хроматографируют на колонке с

2-И -бензои памидогепти памино-4-окси-симм- триаэинилагарозой. Раствор гпикоэидаз проПускают через колонку (0,8 х х 10 см)с гидрофобным сорбентом, промывают исходным буфером до полного удаления несорбированного белка, а затем раста вором этипенгпикопя с линейным градиентом (О 45% по объему) в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0.

Гпикозидазы элюируют с колонки 50"/HbIM раствором этиленгликоля в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0, содержащем

l М .хлористый натрий.

Обессопивание и удаление органического растворителя. Во избежание инактивации гликозидаз элюированный раствор ферментов быстро хроматографируют на колонке с сефадексом Г-50, уравновешенной..:

0,05 М фосфатным буфером, рН 5,0.

Характеристика препарата гликозидаз.

Таким образом выделяют 4,8 мг гликози» даз с удельной активностью по и -нит» р офе н ип- И а це тилф -9-глюк о зам ин иду

Я 6532(5

8,1 ед/мг при 25 С, выход 62Ъ. Гликозидазы, очишенные этим методом 30 раз, содержат такое же количество индивидуСоотношение гликозидаз в экстракте и препарате

81,40

82,00

1,06

1,48

0,38

0,35

1,81

2,00

11,53

0,17

9,00

0,20

1,37

1,56

0,50

2,21

1,67

1,72

ЦНИИПИ Заказ 1222/20 Тираж 512 Подписное

Фипиап ППП "Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Й-Лцетил-/3 -9 -гексозаминипаза (3,2.1.30) и-Глюкозипаза (З.Г,1.20) j3 -PzrnKosegasa (3. 2, 1. 21 ) е -Галактозидаза (3.2.1.22) /3 -Галактозидаза (3.2. 1. 23 ) O -Ксилозидаэа (3.2. 1)

Р -Ксилоэидаза (3. 2. 1. ) а -Манноэидаза (3.2.1.24) Й -Ацетилен -D -гексозаминидаза (3.2.1) Активность выделенных ферментов оп ределяют при 25 С с использованием п-нитрофенилгликозидов соответствуюших сахаров в качестве субстратов, а о концентрации гликозидаз в растворе судят по концентрации белка, определенного методом Лоури.

Формула изобретения

1. Способ выделения гликозидаз методом гидрофобной хроматографии, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью од новременного выделения полного набора гликоэидаэ, повышения их ферментативной активности и чистоты, экстракт ферментов из объекта животного происхождения хроматографируют на 2-Й «бензоиламидо» гептиламино-4-окси-симм-триазинилагарозе. альных гликолитических ферментов, как и в исходном экстракте, что видно из приведенной таблицы.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юш и и с я тем, что адсорбцию осушест» являют в 0,05 М фосфатном буфере при рн 5,0.

3. Способпоп. 1, отлича юш и и с я тем, что элюцию препарата гликозидаз осуществляют 50%-ным раст. вором этиленгликоля в фосфатном буфере, рН 5,0, содержащем 1 М хлористый нат рий.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Hjerten $., Яозеп пеп 1., Pahlman S.

Hydrophobic interaction chromatography. The

sy nthesis апд the изе of Some а Рйу Р cind

aryP ае ivatives of a/arose.3. of СЪготЯофк, 1074, 101, 281-288. р. paibond О., Hegbeg-Aaiband А., 6оМ-.

berg М., Purification of Е.со11 enzyrnes by

chromatography on акр?нрЪЖс се е.

FEB5 1е1Т. 1975, 50(2), 130-134.