Способ определения активности процесса метилирования

Способ определения активности процесса метилирования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (и1654899

Сс ов Советских

Социалистических

Республик (б1) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 16.12.75 (21) 2198961/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.03.79. Бюллетень № 12 (45) Дата опубликования описания 30.03.79 (51) М. КЛ.2 б 01N 33/16

Государстоеинык комитет

CCС Р (53) УДК 615.475 (088.8) по делом изобретеиий и открытий (72) Авторы изобретения

А. М. Бару и Г. Н. Мысько (71) Заявитель

Харьковский научно-исследовательский институт неврологии и психиатрии (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОЦЕССА

МЕТИЛ И РОВАН ИЯ

Изобретение от .осится к области биохимических исследований в биологии и медицине, а именно к способам определения активности процесса метилирования в организме и может найти применение в разработке вопросов диагностики, патогенезе и лечения патологических состояний.

Известен способ определения активности процесса метилирования по интенсивности образования метилникотинамида из никотинамида в присутствии кофакторов (1).

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности определения активности процесса метилирования.

Целью изобретения является повышение точности метода.

Эта цель достигается тем, что никотинамид, тиамин в качестве кофактора, а также метионин, как предшественник кофактора, вводят в организм и определяют количество образовавшегося метилникотинамида в биосубстратах флуорометрически.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят определение исходного (фонового) содержания метилникотинамида в биосу стратах.

При исследовании мочи определение проводят накануне для нагрузки никотинамидом в тот же период суток в порциях, собраиных за 1 ч и последующие б ч — периоды наиболее информативные для оценки динамики выведения метилникотинамида, при определении метилникотинамида в

5 крови исследование его исходной концентрации проводят непосредственно перед нагрузкой. Нагрузку проводят метионином (0,5 — 1,0 г), тиамином (12,5 — б0 мг) и никотинамидом (0,05 — 0,1 r) в зависимости

10 от конкретных задач исследования, возможно варьирование количества веществ в указанных пределах, соответствующих терапевтическим дозам этих препаратов, а также исключение одного из кофакторов.

15 Содержание метилникотинамида определяют методом Хаффа и Перцвейга в модификации Старшова. Активность процесса метилирования оценивают по изменению количества метилникотинамида по сравне20 нию с его исходным содержанием (в абсолютных величинах или в % к соответствующим показателям до проведения нагрузки). Способ поясняется следующими примерами.

25 Пример 1. Больная П. М. П., 43-х лет, диагноз шизофрения, кататоническая форма, рекуррентное течение. До начала лечения психотропными препаратами проведено исследование при помощи предлагаемого

ЗО способа. Для этого накануне дня нагрузки

654899

Таблица 1

Результаты определения изменения зкскрецчи метилникотинамида (по сравнению с фоновым уровнем †мг) в дянамике лечения в условлях проведения нагрузочной пробы.

Время после проведения нагрузочкой пробы

Период обследования суммарно за

5 час

Π— 60 мин.

60 — 300 мин

Средние данные нормы

Пример 1 до лечения после лечения

Пример 2 до лечения после лечения

2,8 0,1

0,5 0,4

З,З 0,6

3,5

0,8

9,4

4,4

5,9

3,6

10,6

9,3

3;2

8,1

7,4

1,2

Пример 1-й — положительный терапевт. эффект. Пример 2-ой — отрицательный. проведено определение содержания метилникотинамида в двух порциях мочи: с 9.00 до 10.00 и с 10.00 до 15.00 (фоновый уровень экскреции). На следующий день исследовали концентрацию метилникотинамида в крови (фоновый уровень), после чего больная получила перорально 0,5 r метионина и через 30 мин 2 мл 5О/о-ного раствора никотинамида и 1 мл 6o/о-ного раствора тиамина внутримышечно, затем в те же часы, что и накануне (с 9.00 до 10.00 и с 10.00 до 15.00), собирали мочу для определспия метилникотинамида и через час после проведения нагрузки повторяли забор крови.

Определение метилникотинамида прово- 15 дят по методу Хаффа и Перлцвейга в модификации Старшова, для этого используют

1 мл крови, взятой из вены, с добавлением оксалата или цитрата натрия. Осаждение белков проводят добавлением двух мл 20

10 /О-ной трихлоруксусной кислоты и центрифугируют в течение 5 — 7 мин при

5000 об/сек. К полученному безбелковому центрифугату добавляют физиологический раствор до 10 мл. К 1 мл разведенного 25 центрифугата, помещенного в пробирку с притертой пробкой, прибавляют 0,5 мл ацетона (не флюоресцирующего) и 0,2 мл 6 ного раствора едкого натрия. Пробирку встряхивают и через 5 мин приливают ЗО

0,3 мл 6%-ного раствора соляной кислоты.

Затем пробирку помещают в кипящую водяную баню на 2 мин, охлаждают, добавляют 1 мл 20%-ного раствора однозамещенного фосфата калия и 2 мл воды (би- 35 дистиллированной). Контрольную пробу обрабатывают точно также, но вместо ацетона добавляют 0,5 мл воды. При определении метилникотинамида в моче, предварительно отфильтрованную мочу разводят 40 в 10 раз, дальнейший ход определения такой же, как и при исследовании мстилникотинамида в крови. Количество метилникотипамида определяют по иптенс возникающей в этих условиях специфической флюоресценции с использованием интсрференционных светофильтров, расчет ведут на основании построения стандартной калибровочной кривой, содержание мстилникотинамида выражается в абсолютном выделении на порцию мочи и в виде концентрации в крови.

После проведения процедуры определения активности процесса метилирования до начала лечения была назначена терапия психотропными препаратами (галоперидол, тизерцин) с четко выраженным положительным антипсихотическим эффектом, это позволило уже через месяц после поступления выписать больную из стационара.

Результаты повторно проведенного, после курса лечения, определения активности процесса метилирования свидетельствуют о практически полной нормализации показателей изменения экскреции метилникотинамида после нагрузки при резко повышенных показателях нагрузочной пробы до лечения.

Пример 2. Больной P. А. Ф., 20 лет, находился на стационарном лечении с диагнозом шизофрения, парапоидная форма, непрерывно-прогредиентное течение. Несмотря на интенсивную длительную терапию (аминазин, трифтазин), при некотором сглаживании аффективных расстройств полностью сохранилась галюцинаторнобредовая симптоматика и другие психотические нарушения. Исследование метилирующей активности в данном случае также как и в предыдущем, было проведено в динамике по принятой (описанной выше) схеме.

654899 следованных групп оказались данные определения изменения экскрецпп метплппкотипамида. Как видно из табл. 2, все 4 обследованных группы статистически значимо отличались между собой, причем различия носили не только количественный характер, но и отличались по направленности изменений по сравнению с нормой. Особенно демонстративны результаты исследования за

I0 период 60 — 360 мин после проведения нагрузки: выделение метилникотинамида исключительно резко увеличено у больных шизофренией, в то время как у больных с циррозом печени оно в такой же степени

15 снижается (изменения достигают высшего уровня достоверности — р 0,001); в несколько меньшей степени сниженпе экскрецип метилникотинамида отмечено в этот период и у больных алкоголизмом без яBHblx при20 знаков цирроза, отличия между этими группами больных алкоголизмом — в псрвый период обследования (Π— 60 мин). При сопоставлении нормы у больных шизофренией видно, что, если у здоровых испытуемых

25 повышение метилникотинамида в моче отмечавшееся через 1 ч после нагрузки, затем практически исчезает, то у больных шизофренией, наоборот, резко нарастает. По динамике изменений отличались также

30 группы больных алкоголизмом с наличием и отсутствием явных признаков цирроза печени.

Таблица 2

Изменения содержания метилпикотипамида в моче после нагрузки яикптинамидом, метиопи ом и тиамипом по сравнению с фогювым уровнем (мг).

Время после нагрузки

Число обследованных

Группа обследованных

60 — 360

0 — 60

0,5 0,4

p)0,2

2,8 0,6

p<0,001

Здоровые

5,5 0,6 р<0,001

1,7 0,2 р<0,001

Больные шизофренией — 4,31-0,6 р<0,001 — 0,4 0,1 р<0,001

Алкогольный цирроз печени — 3,1+1,0 р<о,02

0,3 0,1 р<0,02

Больные хроническим алкоголизмом без цирроза печени

Предлагаемый способ обеспечивает высокую точность определения активности процесса метилирования и может найти применение в разработке вопросов диагностики, патогенеза и лечения патологических состояний, при которых существенное значение придается изменениям активности процессов метилирования, в частности при 40 психических нарушениях.

Формула изобретения

Способ определения активности процесса метилирования по интенсивности образова- 45

Полученные результаты (табл. 1) свидетельствуют, что резко увеличенные до начала лечения показатели прироста метилникотинамида после нагрузки практически не изменились, несмотря на проводившееся лечение (произошло только некоторое «перераспределение прироста» во времени— особенно интенсивное повышение в первой пробе мочи) . Сопоставление результатов исследований в приведенных случаях подчеркивают четкую корреляцию между показателями нагрузочной пробы (по данным экскреции метилникотинамида, которые являются особенно информативными) и не только наличием патологического процесса, но и эффективностью лечения. Это приобретает особенное практическое значение, учитывая дефицит объективных критерием в терапии психических заболеваний, в частности шизофрении. Было обследовано 74 человека, из которых 15 практически здоровых людей, 44 больных шизофренией (галлюцинаторно-параноидная форма), 10 больных алкогольным циррозом печени и 5 больных алкоголизмом без признаков цирроза.

В результате проведенных исследований было показано, что заметное изменение концентрации метилникотинамида в крови после проведения нагрузки по сравнению с группой здоровых наблюдается только в группе больных шизофренией. Значительно более информативными для различных обния метилникотинамида из никотинамида в присутствии кофакторов, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью повышения точности метода, никотинамид, тиампн в качестве кофактора, а также метионин, как предшественник кофактора, вводят в организм и определяют количество образовавшегося метилникотинамида в биосубстратах флуориметрически.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Buscauno G. А., «Acta Neurol. Napoli», 1965, 20, 453 — 455.