Способ получения глюкозоизомеразы

Способ получения глюкозоизомеразы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИ"Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ пщ 655327

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 09.10.73 (21) 1964130/28-13 (23) Приоритет — (32) 10.10.72 (51) М. Кл.""

С 12D 13/10

Государственный комитет (33) США (31) 296000 (43) Опубликовано 30.03.79. Бюллетень № 12 (53) УДК 557.15 (088.8) по делам изобретений и открытий (45) Дата опубликования описания 30,03.79 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Кеннет К. Ши (КНР), Говард А. Ли (США) и Брендан Дж. Доннели (Ирландия) Иностранная фирма

«Анхойзер-Буш, Инкорпорейтед» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

Изобретение относится к способам получения глюкозоизомеразы с использованием микроорганизмов вида Actinoplanes.

Глюкозоизомераза служит для превращения глюкозы непосредственно во фруктозу., поэтому вопросы, связанные с получением этого фермента, имеют важное значение.

Для повышения выхода глюкозоизомеразы при культивировании ее продуцентов в питательную среду добавляют ксилозу или ксилан.

Однако ксилоза — дорогой компонент, а если добавлять ксилан, то для продуцирования глюкозоизомеразы необходимо использовать только такие микроорганизмы, которые являются одновременно и продуцентами фермента, вызывающего гидролиз ксил ана.

Известен способ получения глюкозоизомеразы путем культивирования микроорганизмов (культуры Streptomyces olivacens) ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, без внесения при этом добавок в виде ксилозы или ксилана (1).

Однако активность получаемого по этому способу фермента недостаточна.

Целью изобретения является повышение активности фермента.

С этой целью в качестве продуцента используют микроорганизмы вида Actinoplanes, причем целесообразно из этого вида использовать штаммы Actinoplanes missouriensis ХРЯ1 В-3342, Actinoplanes phillippensis АТСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676, Actinoplanes sp. АТСС

23342.

В качестве источника азота используют или жидкость после замачивания кукурузы, или барду, или гидролизат казенка, или гидролизат соевых бобов, или гидролизат белка рыб, или их смесь.

Предлагаемый способ заключается вследу.ющем.

Исходные культуры вида Actinoplanes культивируют в среде, содержащей источники углерода, азота (например, жидкость ,после замачивания кукурузы) и минеральные соли, при температуре 25 — 30 С, впри,сутствии воздуха в течение l — 2 суток.

При этом среду с культурой размещают на вращающемся вибростоле.

Выращенную культуру переносят в стерильную среду, находящуюся в ферменте655327

3 ре, инкубируют, перемешивая, при температуре от 16 до 40 С (предпочтительно при

25 — 30 "С) и скорости протекания потока воздуха i объем в минуту в течение 1 — 7 суток.

Скорость подачи воздуха можно изменять от 0,3 до l 5 объема в минуту. Для получения максимального выхода фермента величину рН фсрментационной среды поддерживают в интервале между 6,0 и

8,5 (предпочтительно между 6,4 и 7,5).

Максимальная активность изомеразы в этих условиях достигается по прошествии

3 — 5 суток. После этого отделяют клетки микроорганизмов и используют их как источник фермента. Возможен и другой вариант, когда фермент экстрагируют из клеток.

Уровень активности, приближающийся к

30 единицам на 1 мл оульона культуры, достигается по прошествии 3-х суток. единица активности определяется как — î количество фермента, которое можетобразовать

1 мкмоль фруктозы из глюкозы за 1 мин при температуре 75"С в среде, характеризующеися 1,5 М по глюкозе, 0,03 М по фосфатному буферу с величинои рН 7,0, 0,003 М по сульфату магния и 0,0003 М по сульфату двухвалентного кобальта.

Уровень активности изомеразы, достигаемыи при практическом осуществлении настоящего изооретения, меняется в зависимости от применяемого штамма и используемой для выращивания среды. Уровень активности, составляющий ЬО единиц па

1 мл бульона культуры, имеет место при культивировании культуры Actinopl anus

missouriensis 1 КК1 Ы-3342 на среде, содержащей жидкость после вымачивания кукурузы.

Хорошую активность получают и при культивировании Actinoplanes philiippensis

А1СС 12427, Actinoplanes armernacus Л 1 СС

15676 и Actinoplanes sp, АТСС 23342.

Исследование большого количества видов Actinoplanes показало, что практически все виды этой культуры, их суокультуры, мутанты и разновидности способны продуцировать глюкозоизомеразу и поэтому могут быть пригодны для осуществле.ния описываемого способа.

Такое положение объясняется следующим. Поскольку стенки клеток микроорганизмов вида Actinoplanes содержат ксилозу (преимущественно Д-ксилозу), организм должен быть способным синтезировать пептозу. Единственным метаболическим путем для синтеза Д-ксилозы является изомеризация Д-ксилозы изомеризирующим ферментом Д-ксилозоизомеразой, который также обладает способностью изомеризации глюкозы во фруктозу. Д-Ксилулоза может быть ооразована из Д-ксилулозо-5-фосфата при воздействии фосфатазы. Последнее соединение, т. е. Д-ксилулозо-5-фосфат, явля5

ЗО

60 ется важным промежуточным соединением при образовании гексозо-монофосфато-пептозы.

Ниже дана схема биосинтеза Д-ксилозы в Actinoplanes.

Гексозо-монофосфатно-пептозный путь:

1 люкоз а АТф С02

Д-ксилулозо-5-фосфат —., — - Д-ксилулоза

Д-ксилоза — r

>изомеризация стенки клеток.

l1оскольку клеточные стенки Actl1loplanes содержат Д-ксилозу, поэтому все они, как можно ожидать, содержат изомеризующии фермент.

ll р и м ер. Ilo этому принципу получают фермент глюкозоизомеразу путем культивирования микроорганизмов следующих штаммов: Actinoplanes missouriensis NRRL

В-3342, Actinoplanes phillippensis АТСС

12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342.

Зти микроорганизмы хранят по отдельности в форме исходных культур на пластинках с 1,7% триптона, 0,3 /О сойтона, 0,25 "/о глюкозы и 2,0% агар-агара. llpoдукт инокулирования готовят путем переноса исходнои культуры в пробирку с 8 мл стерилизованной среды состава, о/О. триптон 1,7, сойтон 0>3> К НР04 0,25, глюкоза

0,25. 11родукт инокулирования культивируют в этой пробирке при 28"С в течение

2 — 3 суток при встряхивании, а затем его вносят в одну из приведенных ниже сред для выращивания и получения изомеризующего глюкозу фермента.

Среда № 1 содержит следующие компоненты, вес. : триптон 1,3; сойтон 0,3;

К НРО4 0,25; Д-ксилоза 1,0. Ее разбавляют водои до нужного объема. Величину рН среды устанавливают на уровне 7,0.

Питательные вещества (например, сахар) перед внесением стерилизуют.

Среда № 2 отличается от среды № 1тем, что вместо Д-ксилозы вносят 0,25 /о Д-глюкозы, в нее вносят также жидкость после вымачивания кукурузы (3 /о ), сульфат двухвалентного кооальта и сульфат двухвалентной меди. Средой № 3 является барда, средой М 4 и т. д, — пептоновый экстракт дрожжей, продукт гидролиза казеина,, продукт гидролиза соевых бобов, продукт гидролиза белков рыб. Готовят среды и из смесей указанных веществ.

К выбранной из указанных выше сред прибавляют продукт инокулирования из расчета 5 мл последнего на 75 мл среды с триптоном и сойтоном или на 95 мл среды из жидкости после вымачивания кукурузы.

Инкубирование ведут в течение 96 ч при

28" С, среду встряхивают на вибрационной установке. По окончании инкубирования клетки выделяют центрифугированием

30 мл культуральной жидкости при скоро655327

Удельная активность, полученная при использовании среды

Формула изобретения в виде жидкости после высодержащей не содержащей

Д-ксилозу

ActinopIanes

Д-ксимачивания кукурузы лозу а) missouriensis

NRRL Б-3342 б) phillippensts

АТСС 12427 в) armentacus

АТСС 15676 г) sp. АТСС

23342

17,8

20,6

15,2

0,29

2,0

0,87

0,82

0,24

0,10

0,41

1,70

0,48

Составитель М. Андреева

Редактор Н. Хубларова Техред Н. Строганова Корректоры: 3. Тарасова и Л Брахнина

Заказ 572/3 Изд. № 248 Тираж 548 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

5 сти вращения 15000 об/мин в течение

10 мин, промывают водопроводной водой и суспендируют в 14 мл 0,12 М фосфатного буфера с рН 7,0. Полученную суспензию клеток обрабатывают ультразвуком при

4 С в течение 4 мин, а затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин.

Верхний слой жидкости можно использовать как сырой источник фермента, вызывающий изомеризацию глюкозы.

Данные об удельной активности полученной глюкозоизомеразы в зависимости от вида культуры и питательной среды представлены в таблице.

Наибольшей активностью отличается глюкозоизомераза, полученная при культивировании Actinoplanes missouriensis

NRRLB-3342 на среде, содержащей Д-ксилозу.

На качество получаемого фермента оказывает влияние также способ подготовки жидкости после вымачивания кукурузы.

Рекомендуется нейтрализацию этой жидко5 сти вести до рН 7,0 щелочью, а затем ее профильтровать.

При приготовлении питательной среды из этой жидкости добавляют сульфат двухвалентного кобальта и сульфат двухвалентl0 ной меди с концентрацией соответственно

0,1 мМ и 0,05 мМ.

Наиболее высокие показатели дает применение гидрата окиси натрия (по сравнению с гидратом окиси кальция и гидратом

15 окиси аммония).

1. Способ получения глюкозоизомеразы

20 путем культивирования ее продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральной соли, отличающийся тем, что, с целью повышения активности фермента, из микроорга25 низмов продуцентов используют штаммы

Actinoplanes missouriensis NRRL В-3342, Actinoplanes phillippensis АТСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника азота используют или жидкость вымоченной кукурузы, или барду, или гидролизат казеина, или гидролизат соевых бобов, или гидролизат белка рыб, или их смесь.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Великобритании Хя 1280396, кл. С ЗН, опублик. 1972.