Способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях

Способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских.Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

И ЗОБРЕТЕ Н ИЯ

< 1657062

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

l (61) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 15.11.77 (21) 2543104/28-13 с присоединением заявки%†(23) Приоритет—

Опубликовано 5.04.79. Бюллетень № 14 (51) M. Кл.

С 12 К100

//G 0l N ЗЗ/16

Гоаударатвеивьй вмвтет ссср во делам изооретеиий и открытий (53) УДК 576.8. .097.29(088.8) Дата опубликования описания /6. 0 / Я

A. И. Егоров (72) Автор изобретения

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии н гигиены (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОТОКСИНА БАКТЕРИЙ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Изобретение относится к области медицины и биологии.

Известен способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях путем воздействия биологической жидкостью

5 на клетки макроорганизма с последующим определением количества измененных клеток (11

Однако известный способ сложен, длителен (исследование занимает около пити суток) и не обеспечивает высокой чувст- щ вительности.

Целью изобретения является повышение чувствительности, ускорения и упрощение способа.

Для этого по предлагаемому способу биологическую жидкость вводят внутренно в . макроорганизм, отделяют перитонеальную ткань, готовят монослойную культуру перито,.иеальных клеток, прижизненно окрашивакл флуорохромом, ощЮюляют количество-- клеток с окрашенными лизосомами и по величине лизосомного показателя определяют Й4- личие эндотоксина.

Способ осуществляют следующим обра.зом.

Взрослым, практически здоровым, белым мышам весом 20-25 г в хвостовую вену вводят 0,2 мл испытываемой биологической жидкости. Через 60 мин животных забивают путем пережатия области шеи.

Стерильно вскрывают брюшную полость и вливают туда l0 мл стерильного физиологического раствора Хенкса. В счетной камере подсчитывают количество клеток н доводят их концентрацию до 104 клеток/мл.

Клеточную взвесь заливают в плексигласовые коробочки (прямоугольные контейнеры с крышками), на дне которых уложены предметные стекла, выдерживают при 37 С в течение 60 мин. После этого препараты споласкива ют физиологическим раствором, смывая неприкрепившиеся клетки. Эти препараты на стеклах погружают в раствор красителя — акридиноваго оранжевого (I

250000,4 мкг/мл) в растворе Хенкса и инкубируют 60 мин при 37 С. По окончании флуорохромирования препараты отмывают от непоглощенного красителя, накрываютпокровным стеклом и окантовывают их по краям расплавленным парафином для предохранения от высыхания.

657062

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Текред О. Луговая Корректор М. Ряшко

Тираж 575 Подписное

Редактор В. Трубчелко

Заказ l733 28

0НИИПИ Государственного коиитета CCCP по делам изобретений и открытий-! 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб: д. 4/&

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Готовые препараты просматривают с помощью флуоросцентного микроскопа МЛ-2А с бинокулярной насадкой в отраженном свете при увеличении. Количественный учет клеточной реакции на токсическое воздействие осуществляют путем подсчета в препаратах не менее 100 клеток в разных полях зрения.

Из этого количества определяют процент.клеток, в цитоплазме которых выявлялись четко выраженные лизосомы — яркокрасные образования на бледнозеленом фоне цито плазмы. Подсчет производят в трех-четырех параллельно приготовленных препаратах

Данные испытания способа показали, что у здоровых животных в контрольных проба:., где вместо эндотоксина был введен такой же объем (0.2 мл стерильного физиологического раствора бенкса, количество клеток с выявляемыми лизосомами не превышало 20-25о/о. Нахождение таких клеток до

25 /о относится к норме.

При наличии в исследуемоп жидкости эндотоксина и при введении его животному в количестве )О мкг, в том же объеме >кидкости, содержание клеток с лизосомамн, окрашенными акридиновым оранжевь|м, превышает 50 — - 55 /в, а при введении 5 мкг эндетоксина на мышь лизосомный показатель превышает 30 — 35%.

Установление лизосомного показателя выше 30а/р после внутривенного введения Mb!шам испытуемой пробы с подозрением на эндотоксин, считается положительным, т.е. говорит о наличии эндотоксина.

Предлагаемый способ обладает высокои чувствительностью, сокращает время определения вместо 5 дней до 3,5 — 4 ч и не требует сложного оборудования и наличия специальной лаборатории клеточных культуР.

4Я

Способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях путем воздействия биологической жидкостью на клетки макроорганизма с последующим определением количества измененных клеток, отличаюи4ийся тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения и упрощения способа, биологическую жидкость вводят в, макроорганизм, отделяют перитонеальную .ткань, готовят монослойную культуру перитонеальных клеток, прижизненно окрашивают флуорохромом, затем определяют коли- чество клеток с окрашенными лнзосомами и по величине лизосомного показателя определяют наличие эндотоксина.

Источники информации, принятые so внимание при экспертизе

1. Аркадьева Г. Е. «Действие бактериальHbIx токсинов на клетки организма и некоторые механизмы их детоксикации>:.Лвторефе36 рат диссертации, Л., 1963.