Способ получения -аспарагиновой кислоты

Способ получения -аспарагиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Г описАн

ИЗОБРЕТЕН И

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ

{61) Дополнительное к авт, свид"ву(22 Заявлено 090277 (21) 2451483/28-1 с присоединением заявки Я (23) Йриоритет

2 ле

33 13/06

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 3004д g. Бюллетень

668.394 (088.8)

Лата оп бликования опиеаиия 300 (72) Авторы изобретения

И.В. Березин, Е. Н Кондратьев".,- Н.C.Êãoðîâ, В. И. Яковлева, .В. kалофeеваД A.й.Андреева, Л.С.Губницкий и В.Н Цербакова (71) Заявитель

Иосковский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им.И. B. Ломоносова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 -ЛСПАРЛГИНОВОИ КИСЛОТЦ

Изобретение относится к технике получения L -аспарагиновой кислоты и может быть использовано в микробиологии, медицине и пищевой промьлаленности.

Ь

Известен способ полуЧения Ь -аспарагиновой кислоты путем смещения суспензии клеток микроорганизмов,например Рбеодол.опаб 3iquifaciens с

1 М (11, 63) водным раствором фумара- 1О та аммония- и толуолом с последующей инкубацией в течение 48 ч при

37ОС, Недостатком известного. способа является его длительность, загрязнение целевого продукта примесями и периодичность.

Известен также способ получения . -аспарагиновой кислоты путем культивирования микроорганизмов — продуцентов аспартазы с последующим выделением аспартазы из клеток, иммобилизацией фермента на ионообменниках и пропусканием через них водного раствора фумарата аммония.

Недостатком этого способа является необходимость выделения фермента из клеток и быстрое снижение активности 1. -аспарагиновой кислоты. оо

Известен также способ получения

Ь -аспарагиновой кислоты путем культивирования продуцирующих ее микроорганизмов вида ЕаспЕг сЫа соЙ на питательной среде, отделения суспензии клеток от культуральнай жидкости, промывки, иммобилизации клеток путем включения их в полиакриламидный гель, измельчения геля, активации клеток и промывки их фумаратом аммония.

Этот спосоо является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату.

Недостатком известного способа является его длительность и недостаточная эффективность за счет снижения активности аспартазы при иммобилизации клеток.

Цель изобретения — ускорить процесс и повысить его эффективность.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения Ь -аспарагиновой.кислоты в качестве микроорганизмов из вида Escherichia со1 используют ытамм Escher i ch i a соР» 83 или Escherichia cori АН 52, или

Esche r ic hi с са 8 85, при этом активацию клеток осуществляют после

596 ).

Показатель

Контроль

Предлагаемый способ

187

13,1

173

257

122

72,9

210

Удельная скорость элюции

0,5-1,0

0,13 отделения их от культуральной жидкости путем нагревания суспензии клеток при 45-55ОС в течение 40-60 мин, а иммобилиэацию .проводят в присутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9% по весу с последующим охлаждением смеси до

0-10ОС при одновременном воздействии светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс в течение 510 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Продуцирующие L -аспарагиновую кислоту микроорганизмы вида Eache vichia соб штаммы лй 52, 83 или 85 15 культивируют 6 ч на питательной среде (МПБ) при 30-370С затем клетки отделяют, активируют их нагреванием при 45-55ОС, преимущественно при

50ОС, в течение 40-60 мин и далее промывают.

Последующую иммобилизацию проводят в присутствии одной из солей

Длительность процесса, ч

Удельная активность аспартазы,включенных в гель нативных .клеток;

Eacheri ch(a сой ед. активности

Удельная активность аспартазы иммобилизированных нативных клеток

Eacherichia cali. % от свободных клеток

Удельная активность аспартазы включенных активированных клеток

ЕзсИег(сИ а со1(, единицы активности

Эффективность иммобилизации,%

Результаты таблицы показывают, что уменьшение времени культивирования микроорганизмов †продуцентов аспартазы .и времени активации сокращает длительность процесса примерно в 8 раэ. 60

Пример 1. односуточные клетки

ЕасИеисЫа co0(штамм В смывают с поверхности мясо-пептонного агара (МПл) 1-2 мл жидкой стерильной среды и с помощью стеРильной пипетки переносят в посевную жидкую стерильную аспарагиновой. кислоты в количестве

3-9 вес.- и смеси,содержащей вес.%: акриламид 10-20, метиленбисакриламид 0,33-0,66;И,И, И; Ii -тетраметилэтилендиамин 0,00025-0,0005; персульфат аммония 0,0375;.Рибофлавин

0 005. Клетки вместе со смесью освещают светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс с одновременным охлаждением до 0-10 С в течение 5-1.0 мин.

Затем гель измельчают и пропускают через него водный раствор Фумарата аммония со скоростью элюции

0,5-1 0 при 25-37 С.

Получают чистый продукт с выходом 88-95% потребленного фумарата.

Продукт кристаллизуют подкислением раствора до РН 2,5-3,0, кристаллы отделяют фильтрованием, осадок промывают этиловым спиртом и высушивают на воздухе.

Данные сравнительных испытаний по предлагаемому способу и известному (контроль) приведены в таблице. среду того же состава. Культуру выращивают 12-18 ч глубинным способом при .30-35 С в качалочных колбах

750 мл (объем среды 50 мл).

Затем посевной материал в количестве 2-3% вносят в среду того же состава и выращивают тем же способом 6 ч в аналогичных условиях в качалочных колбах с объемом среды по 125 мл. Клетки отделяют от среды на центрифуге С-44. Из 4 л среды

6596) 1 за ) ч и 1100 .ед. 11 . °:) -: ной), а без освещени — 5 е;, а

1 мг белка за 1 ч II, 230 еп, (, 8- от внесенной) и поли ..с риза (ття в эттэм случае протекает 60 мин, Пример 2, Клет < -т E. СО!., штамм AH 52 выращивают, If гo"., .<)" вят суспензию согласно при(.т(э;:у

Содержание бел)<а раBII<) 39, 368

1 мл суспензии клеток, удельна- активность — 25 ед. на 1 мг Gn)II а за 1 ч. Иммобилизацию клето:< б:<в терий проводят, как в примере 1, II двух одинаковых образцах, внося в каждый по 67,5 мг белка с общей активностью аспартазы 1685 ед. Отличие между образцами состоит в том, что в одном случае в смесь для фотОП)ОЛИт((ЕР тзап .rr ПО)ТИа1<Ритда(<тт ПСЭ. С) геля,добавляют 150 мг дикалиевсрй

СОЛИ, аСПаРа1(итПОВОй КИСЛОТЫ, а В другом не д(оба(т ляют, l0

Аспарта з ную активность вк rf<,- prfных в полиакриламиднмй гель клетсэт< бактерий опрЕделяют, как в примере 1.

Клетки бактерий, иммобилтизованпые 25 в присутствии соли аспарагиновой кислоты, имеют удельную и общую активность соответствепно 74,0 ед. на 1 мг белка за. 1 ч и 3530 ед., т.е.. 210% от исходной; без соли 80 аСПаРаГИНОВОй КИСЛОТЫ СООт)ЗЕтСтВЕННО

2,58 ед. Иа 1 мг белка за 1 ч и

130 ед., т.е,, 8,7о оот исходно т. Общей активности.

Пример 3. Клетки Р. „-pP.;

/, штамм Кр выращивают, как в примере 1,, 40 мл суспензии непромытых клеток с содержанием белка 57 0 мг в 1 мл и удельной активностью 57 ед.. на 1 мг белка за 1 ч разделяют на две равиII дозы, 20 мл этой суспензии про".тьтвают от балластных белков как H.пример:-. 1, и получают 20 мл суспензии .:<т(етот< бактерий с обозначением нат)тинь)) и содержанием белка 29, 7 мг в 1 мл, Другие 20 мл суспензии неотмытых бактериальных клеток вначале -агре-вают 40 мин при 50 С, а затем отмывают от балластных белков, как в примере 1, получая 20 мл суспензии клеток с Обозначением активирован-. 50 ных с содержанием белка 27,06 мг в 1 мл. Включение бактериальных клеток в полиакриламидный .гель осуществляют, как в примере 1.

Затем определяют;аспартазную активность. свободных и включенных в полиакриламидный гель нативных и активированных клеток Е.сои штамм Кр как в примере 1. Получают свободные и иммобилизованные нативные клетки E.со0I ",p с удельной аспартазной,активностью, соответственно равной 108 и 187 ед. на

1 мг белка за 1 ч, а тато(се свободные и иммобилизованные "активированпые клетки E со6< Кр с удельнбй аспар- 68

;;< ЭП)ПСЭСт,:К;. т.ОСтВЕтC«ВЕННО

:: 1-с и ." GG " 2 "7 ед., ".", 1 мг белка

) . е 4 ".";е "к E.ca(I

Кт. выращ::-: с):() т, к,- I< в примере 1, ) 0 м... C-!CI

,- - П т

Q срт, -.; òàc::.I.íõ б:;сов, как в приме;.с :У- ".Ff 10 if . Оус.пензии акти. =":1<. ":,сп:иf!; клето. . содержащих 35,2 мгм

1 тлатт И тт"„". « <)IIX УДЕ)ЛЬНУЮ

:-:в ость «cffàpò».çû 27,8 ед.на 1 мг белка за 1 -:.. 5,1 мл этой суспензии с содержа IIIcì 179 мг белка с общей

;..-..спартазной активностью 4999 ед. ,,;.)бавляют к трой((-т»эт"ту количеству всех сос -.вить))с частей для фотополимеризации полиакриламидного геля указанньтх в . пт)иматре 1 . . .:,Inò) ." r ";: û f,:). .:)М=.PHÇBU,ÈÈ И ИЗ

;.;.-;;;-.,-.ен: полиа<р-„ .ë»ìf<äíoão геля, как п1)::":..ер =: 1. 1ас:,:)<:::.ь. измельченного

-, (.)т.,fi«((т«)яа.ь С 4 рава ПОрцИяМИ

G . i)1 "„()ncôfI <рого буфера UH 7 т С пО и .соби)сеют 1 50 мл прОмыВ ных т С вЂ”. "- -От-". С ) Л=т" . 69 1т бЕЛКа

-r 19 " О. Од, обще.; активности аспарта -т

Р о т к и амидьый гель включан)т ("лс.«", т) r", ео Я т К3:), ктэтттттт ство котот р.:з< .-::о .=-етствует 110 мг белка или .-;. .С СодЧОС-О тЭЛИЧЕСтВа. ВКЛЮЧЕНн:-, =- в гель клетки и. сеют удельную па:-тазпусв активно ть 119 ед. на за 1 =- и общую 13200 ед. ;?6:.": .-.= .песенной). Все полученное

-..Që-1ecт:-о частиц пОлиакриламиднОгО гэри:.:.-..-.-..".è".вче . I..-(ми в него;клетками; .=, Осэ 1); Хр переносят в колонку

1,.8х7<:.з с,. и Объемом 19,1 см . Чертзз .;.:..—;;-эп)»,; „...-:,")мост .тированную при

3",.""(3, пропускают 1,)". 1 14 раствора .,:"::;,Рата а.:)МО)-„Я, ПРтИГОтОВЛЕННОГ<Э, В I: !Ç -.r!n; С 1т CO СКОроотЬЮ 10 МЛ/Чт :..ГСР С C<С)ЗЕ.. СтВУЕВ,;"ÄÅËÜÍÎé СКОРОСТИ ,—,Ю)-,;,т 0,525. С:ОбвраЮт 1 Л ЭЛЮата, в ..<о .Ором содержание аспарагиновой

;:исспотьт равно 0,865 И, а фумаровой

0,012 И, т.е. молярный выход образоВа,!(f=йоя аопараГИНОЬОй КИСЛОТЫ ПО

Отноше.-..ию к потребленному фумарату равен 883.

К 1 л элюата добавляют концентрированную серную кислоту до рВ 3,0, выпав.т)ий обильный осадок отделяют фильтрованием, промывают последовательно двумя порциями холодной воды до 50 мл и 50 мл 96%-ного этилового спирта и сушат до постоянного веса на воздухе, получая 110 г аспарагиновой кислоты, которая в б г НС имеет (a) > = +25,5< ). Это указывает на 100Ъ-ное содержанке L -формы в целевом продукте.

В целевом продукте не обнаруживают фумаровой кислоты — исходного --"-ырь)- е

Полученная L --аспарагиновая .И-..)1ота дает одно пятно при хроматографттровании на пластинках

659611

Составитель я.Бражникова

Рд акто »1. мит нева Тех ед 3.Фанта Ксррек-.îp О.Билак

»

Тираж 525 Подписное

НИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобрет" íèé и открытий

113035 Москва» Ж-35 Ра шская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, r.Óærîðîä, ул.Проектная,4

@ p Ц

Заказ 2120/б Силуфол и Фиксион, как указано в примере 1, и один пик на аминокислотном анализаторе фирмы Хитачи (Япония), точно "оответствующий стандартной (-аспарагиновой кислоте. Целевой продукт не загрязнен клетками микроорганизмов. Элементарный микроанализ содержит,Ъ:»

4,90% Н, 36,48% С, 10,49% М, что соответствует теоретическому содержанию этих элементов в аспарагиновой кислоте (5,301% И; 36,09ЬЪ С; »О

10 52%К) °

Предлагаемый способ .получения Ь— аспарагиновой кислоты по сравнению с известным техническим решением той же задачи обеспечивает повышение эФФективности процесса за счет сокращения времени активации клеток микроорганизмов и повышения их активности перед иммобилизацией, а также увеличения скорости элюции

20 исходного сырья через колонку.

Формула изобретения

Способ получения Ь -аспарагиновой кислоты путем культивирования про25 ду»1ируюших ее микроорганизмов вида

Each e» r c h» c» со б на питательной среде, отделения суспензии клеток от культуральной жидкости, промывки, иммобилизации клеток путем включения их в полиакриламидный гель, измельчения геля, активации клеток и промывки их фумаратом аммония, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения его эффективности, в качестве микроорганизмов из вида Egctzev»ch»c» со » используют штаммы Eache» »c)»»c» со1»

83 или Etcher»ch»a coE» АК 52, или

Etcher»ch»c» coE» 85, при этом активацию клеток осуществляют после отделения их от куль-.уральной жидкости путем нагревания суснензии клеток при 45-55 С в течение 4060 мин, а иммобилизацчю проводят в присутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9 вес.Ъ с последующим охлаждением смеси до 0-10 С при одновременном воздействии светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс в те-ение 5-10 мин.