Способ получения ферментного препарата -галактозидазы

Способ получения ферментного препарата -галактозидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И II: А If KИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскнк

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено Об057б (21) 2357215/28-13 с присоединением заявки № — ю

С 21 Т3 13/10

Гоеударетвеииый комитет

СССР по делам изобретеинй и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 300479. Бжллетснь ¹ 1б

Щ уД((577.15,08 (088.8) Дата опубликования описаиий 300479 (72} Авторы изобретения

Н. Н.Иомот, О.H.Поляков, Б.л.Галынкин, B.Ô.Çòòíнгер и В.К. Грекова

Ленинградский научно-исследовательский институт антибиотиков (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕН ГНОГО ПРЕПйРАТЛ

Р-ГЛЛЛКтОЗИДЛЗЫ

Изобретение относится к технике получения ферментных препаратов с помощью микроорганизмов, в частности ферментного препарата Р -галактоэидазы, используемого в медицине.

Известен способ получения ферментного препарата f3 -галактозидазы путем глубинного культивирования ее продуцента -штамма 7 CuvvuРаг(а паЕона Pjs на питательной среде в усло- 10 виях аэрации и выделения целевого продукта из нативного раствора jig

Известный способ является наиболее близким решением к описываемому изобретению по технической сущности ®5 и достигаемому результату.

Недостатком известного способа является то, что он обеспечивает невысокий .уровень ферментной активности в нативном растворе (1-2 ед/мл),®

Кроме того, выход ферментного препарата по известному способу недостаточно высок.

К недостаткам известного способа относится также необходимость 28 многократного осаждения для получения растворимого препарата и сложное аппаратурное оформление.

Целью изобретения является повышение активности ферментного препа- 80 рата в натив ном растворе, а также увеличение его выхода.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе получения ферментного препарата Р галактоэидазы культивирование продуцента Ва питательной среде ведут в присутствии соевого.i.pотa в количестве 1,0-2,0Ъ от веса пи"ательной среды, а выделение ферментного препарата из нативного раствора осуществляют путем сорбции его на высокодисперсном катионите КИТ с десорбцией цитратным буфером, последующей ультрафильтрацией раствора через ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 80-150 А при рН 4,2-7,0 и лиофильной сушкой.

Кроме того, для снижения потерь фермента oz инактивации в процессе сорбции нативного раствора его подкисляют 50%-ной уксусной кислотой.

Способ осуществляют следующим образом.

Культивирование продуцента Я галактозидазы — штамма 7Cuvvu аг а нтае цабб проводят глубинно, в условиях аэрации на питательной среде, содержащей соевый шрот в количестве

1,0-2,0Ъ от веса питательной среды, 659612

Т а б л и ц а 1

Характеристика культуральной жидкрсти на сливе номер ферментации

Объем аппарата, л

Особенность ферментации

Содержание лимонной кислоты мг/мл

Активность фермента, ед/мл рН

Продолжи тельность

Ферментации,час

1 100 4,6 72

2 100 4,9 72

Питательная среда содержит 1,5-2,0% соевого шрота

5,0

3,0

3,0

3,2

3 100 5 0 96

4 100 5,0 96

5 100 4,9 96

2, 0

3,8

4,0

4,0

2,0

3,6 итатель ная среда не содержащая соевых шрот (данные

10 операций) 100

6,0

7,0

1,83 получая нативные растворы с активнос. тью 3,0-4,0 ед/мл.

Затем из нативного раствора выделяют Ферментный препарат путем сорбции на высокодисперсном карбоксильном катионите КИТ с размером зерна 20-40 мкм, промывки и десорбции цитратным буфером.

В процессе сорбции нативный раствор подкисляют 50%-ной уксусной кислотой.

Далее проводят ультрафильтрацию раствора через ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 80- 150 А при рН 4,2-7,0 с последующей лиофильной сушкой.

П р и м.е р. Культивирование продуцента ф -галактозидазы проводят в глубинных условиях на комплекс. ной питательной среде состава,: соевая мука -2,0; лимонная кислота—

1,5; К НРО4- 0,4; (МЛ„} S0@- 0,2 ;

Выделение и очистку фермента проводят путем сорбции его на высокодисперсном катионите — смоле КИТ и дисперсностью 20-40 мкм, взятом в количестве 40 г, на трехступенчатой цинтрифуге, при этом подаваемую через загрузочное устройство жидкость последовательно фильтруют через 3 слоя смолы. Смолу готовят путем последовательной ее обработки 1 н соляной кислотой, дистиллированной воKCI? - О, 05; М9БΠ— О, 01 5; адек аноль, пропинал — 400, 0,04; соляная кислота до рЫ 2,9., Культивирование проводят в 100 л ферментере с перемешиванием при 280-350 об/мин, подачей воздуха в количестве 1 объему объем среды в мин при 28 + 1 C в течение 72-96 час °

В процессе ферментации в течение первых 48 час происходит интенсивное потребление лимонной кислоты, повышение рН среды и биосинтез фермента -галактозидазы. Ферментация заканчивается при рН 4,7-5,2, активность фермента в среде 3,0-4,0 ед/мл, содержание лимонной кислоты - 2,05,0 мг/мл.

Сравнительная характеристика процесса биосинтеза fb — галактозидазы на известной среде и предлагаемой приведены в табл.1. дой, 1н NaOH в 2 н ИаСР,а затем 2 н

Й аС6 и 0,5 М адетатным буфером при рв 3,7.

Сорбцию проводят из нативного раствора объемом 13,5 л, при этом сорбируется 73-75В фермента от общего его содержания в нативном растворе.

Результаты сорбции р -галактозидазы из нативного раствора приведены в табл.2.

659612 Таблица 2

Активность

Количество, мл

Белок, ед/мл общая ед. В

13500 3,70 .1,83 24705 100 100

3,77 0,10 306 1,2 12 2

Фракция 1 3000

Нативный растФракция 2 3000 3,67 0,15 456 вор после сорбции

Фракция 3 3000 3,67 0,48 1455

17,0

Фракция 4 3000 3,67 0,71 2145

8,7

17 9

Фракция 5 1500 3,67 l 40 2100

7,5.Сумма по сорбции 13500 - - 6462 26,1 71,1

После сорбции смолу промывают

1 л 0,033%-ной уксусной кислоты (рн 3 5) и-дистиллированной водой. 30

Данные анализа промывки смолы после сообщения. приведены в табл. 3.

Таблица 3

Количество, мл

Наименование раствора

Активность елок

Ъ от сорПримечание бир.кообщая ед личества

Уксусная кислота 0,033%, рН 3,5

3,75 0,25 125 1,5

4,20 0,00 - 1,0

5,6

500

Фракция 1

Фракция 2

500

Дистиллированная вода

Слабо-желтый цвет

Желтый цвет

500 4,48 0,00 - 0,3 1,1

500 4,54 0,00 — 0,4 1,4

Фракция 3

Фракция 4

Суммарные значения

2000 — — 125 3,2 11 7

Десорбцию проводят 0,1 И Йа— цитратным буфером при.скорости . 0,5 л/часа, при этом снимают 97,8В

fb -галактозидазы (65,5% белка от сорбированного количества)е

При этом достигается концентрирование в 18,4 раза.

Содержание белка в высокоактивных фракциях - 9,7% от общего количестна в исходном нативном растворе или 35,5Ъ от сорбированного белка.

Данные десорбцнн (Ь вЂ” галактозида65 эы приведены в табл.4.

Наименование ферментного раствора

Исходный раствор для сорбции

Буро-желтый цвет(цвет исходного нативного растворажелтый) IYI

, ъ 3 1

6596,2

Т а б il и ц R 4

А,г т ив,г осСт .-"пень гепень чистки т белНаименование ферментного раствора, фракция

Количество,, МЛ

Белок б От концентр, гс / ед/мл ед.;, 1 рП исходног содержания

О/5

100 3,9 0,04

4 0,0

562 3,15

0,05

0,0

10,7

lOr; 3,7

5,62

27,06

3,07 0,23

34 70 0,92

33,55 2,19

26,42 3,10

14,06 3,31

100

3, 9

2706 15 2

6140 34,4

17,0

11,4

100 4,2 61 40

103 4„4 48,.35

100 4г6 25,73

100 4,7 5,40

4980 28 0

2573 14,4

540 3,0

6 5

3,1

Зе 34

3 5

2,02

0,6

100 4,. 75 л4

?44 0.,99 3.,33

0,3

110 4„90 0,55 60 ;22 0,30

Суммарные значения

17810 3100

Формула изобретения

Составитель А.Бражникова

Редактор Л.Грязнова Техред Э,Чухик Корректор О.Билак

Заказ 2120/6 Тираж 525 Подписное

ЦЛИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ПП13 Патент „г.Ужгород,ул.Проектная,4

Лалее осуществляют ультрафильтрацию раствора через ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 80-3.00 А в ячейке с перемешиванием, при .этогл освобождаются от желтого. пигмента и от 25-30% балластных белков, Полученный раствор фермента сушат лиофильно 24 час, получая кристал-лическую пористую массу светлокоричневого цвета с удельной актив- 38 ностью 5760 ед/г, быстро и хорошо растворимую в воде.

Предлагаемый способ получения ферментного препарата j5 -галактози-дазы позволяет по сравнению с извест.

40 ным техническим решением той же задачи повысить активность ферментного препарата с 1-2 ед/мл до 3,04,0 ед/мл и увеличить его выход.

1. Способ получения ферментного препарата Ь -галактозидазы путегл глубинного культивирования ее про- 50 дуцента - штамма 7Снг"vufar ra rneaquo06б На питатеЛЬнОй сРеДе в условиях аэрации и выделения целевого продук"а из нативного раствора, о т л и— ч а ю Ш и и с я тем, что, с целью повышения активности ферментного препарата в нативном растворе, а также увеличения его выхода, культивирование продуцента на питательной среде ведут в присутствии соевого шрота в количестве 1,0-2,0% от васа ггитательной среды, а выделение ферментного препарата из нативного раствора осуществляют путем сорбции его на выходе высокодисперсном кати- оните KNT с десорбцией цитратным буфером с последуюшей ультрафильтррцией раствора. через ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 80-150 А при ргг.4,2-7,0 и лиофильной сушкой.

2.- Способ по п.l, о т л и ч а юiran и и с я тем, что.с целью снижения потерь фермента Or инактивации, в процессе сорбции нативного раствора его подкисляют 50%-ной уксусной кислотой.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

r3 480759, кл. С 12 З 13/10, 1972.