Способ получения полинуклеотидлигазы, индуцируемой фагом т4 в клетках
Иллюстрации
Показать всеРеферат
ОПИСАНИЕ
ИЗОЬГЕтЕНИЯ "" 6596 4 к Ааторскому свидетельств (61} Дополнительное к авт. свид-ву— (22} Заявлено 110477 (2l} 2473287/28-13 с присоединением заявки № (23} Приоритет—
Опубликовано 3004.79.Бизллетень %16
Дата опубликования описания 300479 (ЬЦ N. - Кл.
С 1233 13/) 0
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытий (е)ф} ЩК 662. 18 (088. 8) (72} Авторы изобретения
A,Ñ.Ñîëoíèí, И.Л.Глухов, B.È.ÒàíÿøèH и A.A.Áàåâ
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДЛИГАЗЫ, ИНДУЦИРУЕМОЙ ФАГОМ Т4 В КЛЕТКАХ
) ESCHERiCHiA СОИ
Изобретение относится к способам получения ферментов, а именно к способам получения высокоочищенных
ДНК-лигаз, которые находят применение в генно-инженерных экспериментах и в исследованиях структуры и функции ДНК.
Наиболее близкий пс степени очистки препарат фермента получается при применении метода, предложенного
Panet A. с соавторами. В этом способе в качестве источника фермента используется экстракт клеток Е. сос 1 В > зараженных фагом T4am и 82, который освобождают от обломков клеточных стенок центрифугированием. Белки неочищенного экстракта фракционируют сульфатом стрептомицина, сульфатом аммония, диализуют против буферного раствора, затем проводят фракционирование и хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, хроматографию на фосфоцеллюлозе и гидроксилаппатите и концентрирование препарата фермента. Выход -2-4% активность до 10000 ед/мг белка (11 .
Недостатком этого метода является низкий выход целевого продукта, наличие большого количества трудоемких стадий,что очень замедляет выделение фермента и приводит к значительной инактивации препарата ДНК-лигазы.
Целью предполагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта, степени очистки и упрощение процесса.
Указанная цель, достигается тем, что экстракт Е.cori-В, зараженный фагом Т4 am Й 82, фракционированный растворами сульфата стрептомицина, сульФата аммония, хроматографируют на двух соединенных последовательно между собой колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюлозой (Р-П) с после" дующей хроматографией на двух последовательно соединенных колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и ДНК-агарозой.
Концентрирование элюата осуществляют переосаждением сульфатом аммония или с помощью небольшой колонки с фосфоцеллюлозой Р-П ° Выход целевого продукта 10%. Удельная активность полученного этим способом препарата фермента 15900 ед/мг белка. 3а единицу активности принимается количество фермента, необходимого для перевода в резистентную к экзонуклеазе Ш Форму 10 О/» М поли(A-Т) при 37 за
30 мин.
6596
Ца 0Tcутствие зк зснуклеаз указывает полное сохранение концевой дезоксинуклеотидной последовательности при длительных инкубациях (60 час) больших количеств фермента с ДНК.
Препарат фермента совершенно свободен от эндонуклеаз, не понижает уров- 5 ня биологической активности ДНК при тра нсфек ции.
Пример . Е.со1» В выращивают до титра 6-7>10 бактериальных тел в мл при 37 С с интенсивной аэраци- 10 ей на среде следующего состава (r на
1 л): йH4Ce — 1, М ЗО,„— 0,13, КН Р04 — 3, М а НРО4 — 6, глюкоза — 4,. казаминовые кйслоты — 2. Заражают фагом T4om М 82 с множественностью 5 15 фаговых частиц на клетку и продолжают выращивание в течение 1,5-2 час.
Зараженные к,летки собирают центриФугированием. Все дальнейшие операции проводят на холоду (0 +5 C) ва всех буферных растворах присутствует
10m М трис-НС3 рН 7,5 и 10m N-2-меркаптоэтанола (А), клетки (100 г) дезинтегрируют, белки экстрагируют буфером A и освобождают экстракт от разрушенных клеточных стенок центрифугированием. Экстракт осаждают
0,6-0,7Ъ сульфатом стрептомицина, центрифугируют. Осадок отбрасывают.
Супернатант осаждают сульфатом аммония при ЗОЪ насыщения. Осадок отбрасывают. Супернатант осаждают, доводя концентрацию сульфата аммония до
55Ъ насыщения. Осадок растворяют в буфере Л с 0,1 N YaC3 и диализуют против буфера А. 35
Посадку на соединенные последовательно колонки с ДЕЛЕ-целлюУ»озой (100 мп) и фосфоцеллюлозой (50 мл) проводят в буфере с 0,2 М МаС0 т.е. в условиях, когда фермент связывает- 40 ся лишь со вторым ионообменником (фосфоцеллюлозой), и элюируют, ступенчато повышая концентрацию ИаС3.
Фракции элюата, содержащие ДНК-лигазу, диализуютпротив буфера А в re- 4 чение ночи. Затем проводят хроматографию на совмещенных колонках с
ДЕАЕ-целлюлозой (100 мл) и 10 мп ДНК14 4 агарозой (однонитевая ДйК, выплавленная в агарозу). Элюацию проводят градиентом конце»»трации ИаС6 в буфере сразу с обоих сорбентов. Применение ионообменников в такой последовательности позволяет резко сократить их объем. ДНК-агароза прочно связывает многие нуклеазы и эффективно очй»»»ает препарат фермента. Элюат, содержащий ДНК-лигазу, концентрируют с помощью колонки гидроксилаппатита (1-2 мл) или переосаждают сульфатом аммония. Полученный препарат фермента диализуют против 60Ъ-ного глицерина в буферном растворе А.
Предлагаемый способ позволяет получить препарат фермента с 10-15Ъ выходом. Препарат фермента имеет
15000 ед/мг белка и свободен от нуклеаз. Сокращено число операций и время выделения за счет соединенных колонок в определенной последовательности., Формула изобретения
Способ получения полинуклеотидлигазы, индуцируемой фагом Т4 в клетках Es» hev»ch»a eo0» предусматривающий заражение клеток фагом, дезинтеграцию клеток, экстракцию, центрифугирование экстракта с последующим осаждением сульфатом стрептомицина, а затем сульфатом аммония, диализом и хроматографией .раствора, содержащего фермент;. по окончанию которой раствор концентрируют с помощью колонки гидроксилаппатита, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, степени очистки и упрощения процесса, хроматографию проводят сначала на соединенных последовательно колонках с
ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюлоэой, а затем на колонках с„ ДЕАЕ-целлюлозой и ДИК-агарозой.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. В»ос1»е»пЬ1гу 1973, 12,р.5045.
Составитель А.Солонин
Редак тор И, Грязнова Техред О.Андрейко, Ко»>ректор О Вилах
Заказ 2120/б Тираж 525 Подписное цяИИПИ, Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035 Москва Ж-35 Ра ская наб. д.4/5
Х х уш
Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4