2- -бензоил амидогептиламино-4-окси -триазинилагароза,как сорбент для гидрофобной хроматографии гликозидаз

2- -бензоил амидогептиламино-4-окси -триазинилагароза,как сорбент для гидрофобной хроматографии гликозидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

«i>660975

Союз Советских

Социалистических ае публик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 100377 (21) 2460959/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет— ($)) (л.2

С 07 6 7/02

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 050579- Бюллетень ¹ 17

Дата опубликования описания 050579. (53) УДК 543.544. .2 (088.8) (72) Авторы изобретения

A. A. Артюков и Н. В. Молодцов

Тихоокеаьский институт биоорганической химии () заявитель дальневссточного научного центра Ан сссР (54) N-БЕНЗОИЛАМИДОГЕПТИЛАМИНО-4-ОКСИ-Sym-ТРИАЗИНИЛАГАРОЗА КАК СОРБЕНТ

ДЛЯ ГИДРОФОБНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ГЛИКОЗИДАЗ

Ъ"П-It 4" /

0Е

СН,он

ОН 0 9-15

Изобретение относится к новос му химическому соединению, а именно, к производному агарозы †. 2-Nгде R- - (CH ), NHC0C H .

2-N-Бензоиламидогептиламино-4-окси-Бут-триазинилагароза является из- 15 бирательным гидрофобным хроматограФическим сорбентом гликозидаз, в частности N-ацетил-p-D- ãåêñîçàìèíèдазы(К. Фт 3. 2. l. 52) и 15-галактозидазы (К . Ф. 3. 2. 1. 23), она 20 может быть использована в биохимическом производстве для выделения.

2ОИ

О а!2

ОН О

-бенз оиламидогептиламино-4-окси-Sym-три азинилагарозе формулы концентрирования, иммобилизации и очистки этих ферментов.

В литературе описан ряд химических соединений, производных агарозы, которые применяют для очистки ферментов посредством гидрофобной хроматографии.

Известен, например, ряд соединений общей формулы

660975

ОН !

Он -О-й -Ы- Н2-О1

2 2 сН20Н

ОН О

ОН 0 ты содержат 40 мкмоль алкильных и

15 арильных групп на 1 мл сорбента. М11-Я ,о-(i

ОН Он

ОН О

15-20

25 -150 где R-- (СН д) „, ИНСОСН3, n = 4, 7 (CHO) л NIICOC6 IIs, n = 4, получаемых посредством конденсации моно-N-ацилалкилдиаминов с агарозой, 30 активированной трихлортриазином (3).

Содержание моно-N-ацилалкилдиаминов в таких сорбентах 7-12 мкмоль на

1 мл сорбента.

Однако перечисленные гидрофобные сорбенты обладают рядом существенных недостатков.

Во-первых, активация сефарозы

4Б бромцианом приводит к получению сорбента с ярко выраженными ио <ообменными свойствами (рк 10 для

N-ацилзамещенной имидокарбаматной группы), сильно ослабляющими процесс гидрофобной хроматографии ферментов. Кроме того, ковалентная связь между алифатическими или ароматическими аминами и бромциан-ак,тивированной агарозой является лабильной в присутствии сильных нукпеоФилов, что в значительной степени затрудняет провецечие хроматографии и регенерацию сорбента в нуклеофильных буферных системах.

Во- вторых> эти сорбенты не являются избирательными гидрофобными сорбентами гликоэидаз,так как неболь- шая длина их углеводородных боковых цепей недостаточна для специфического гидрофобного взаимодействия с этими ферментами, В-третьих, временнообраэующиеся мицеллоподобные 60 . комплексы между этими сорбентами и гликозидазами характеризуются низкой константой связывания, сильно зависящей от ионной силы, рН и природы используемых буферов, что негпе В-- (СН )„, СН3, — (СН2 ) > C< H> 6 . I )

n = 1-10, которые йолучают посредством конденсации алифатических или ароматических аминов с .бромциан-активированной агарозой (1). гДе В--(CHq)q СН>,-C Hs

n = 5, 6, 7, которые получают эпоксидированием агарозных алифатическими или ароматическими эпоксидами (2). Эти сорбенПолу ейные производные содержат

10-20 мкмоль алкил- или ариламина на

1 мл сорбента.

Для целей гидрофобной хроматогра-. фии используют также ряд других соединений общеи формулы

Известен также ряд соединений общеи формулы удовлетворительно отражается на прочности сорбции гликозидаз и их элюции в процессе хроматографии.

В-четвертых, эти сорбенты, наряду с гликозидазами, связывают значительное количество других белков и ферментов, что не позволяет осуществить выделение и.очистку гликозидаз непосредствечно из биологических экстрактов.

Цель изобретения — синтез нового сорбента, устраняющего указанные недостатки ранее описанных сорбентов.

Указанная цель достигается за счет того, что в качестве сорбента используют новое производное агарозы — 2-И-бензоиламидогептиламино-4окси-Sym-триазинилагарозу общей формулы Т. Этот сорбент является избирательным гидрофобным хроматографическим сорбентом для выделения, иммобилизации, концентрирования и очистки гликозидаз, в частности N-ацетил- P-D-гексозаминидазы(К. Ф. 3.2.

1. 52) и Р-галактозидазы (К. Ф. 3.

2. 1. 23) . Он может быть использован в биохимическом производстве.

Согласно изобретению описывается химическое соединение, производное агарозы-2-N-бенэоиламидогептиламино-4-окси-Sym-триазинилагароза указанной общеи формулы 1 в качестве сорбента для гидрофобной хроматографии гликозидаэ.

2-N-Бензоиламидогептиламино- 4-окси-Бутп-триазинилагарозу получают способом аналогом — четырехстадийным синтезом: 1) активация агарозы трихлортриазином, 2) замещение атома

660975

2 (/ и — <.01Г

О О 0

20Н

+25-150 хлора в 2, 4-дихлор-S ym-триаэиниг агарозе гептаметилендиамином, 3) гидролиз хлора 2-аминогептиламино-4-хлор-Яутп-триазинилагарозы и 4) N-бензоилирование полученного соединения.

Активацию агарозы трихлортриазином проводят в слабо щелочной среде при рН 8,5-+0,5 для достижения максимальной скорости активации и для связывания образующейся в реакции хлористоводородной кислоты. Замеп<ение одного из атомов хлора гептаметилен- 10 диамином в трихлортриазин-активированной агарозе осуществляют обработкой

2,4-дихлор-Sym" триазинилагарозы раствором соответствующего диамина в

0,7 М бикарбонатном буфере рН 8,3-9,0-15

При этом значении рН достигается максимальное включение гептаметилендиамина в агарозный гель. Замещение атома хлора r 2-аминогептиламино-4-хлор-Sym-триазинилагарозе на гидроксил проводят последующим гидролизом этого соединения в 0,5 М карбонатном буфере рН 10,0 — 10,5 при 20 С в течение 30 мин. Бензоилирование 2-аминогептиламино-4-окси-Sym -триазинилагарозы бензойк эй кислотой осуществляют в водно-диоксановом растворе в присутствии дициклогексилкарбодиимида.

Таким образом, введение в агарозный гель гидрофобной молекулы N-бензоиламидогептиламина резко меняет гидрофильность этого полимера и способствует обратимому образованию мицеллоподобных комплексов между выделяемыми ферментами и гидрофобными участками геля. Применяя условия, необходимые для диссоциации таких комплексов, получают нативные ферменты. 2-N-Бензоиламидогептиламино-4-окси-Sym-триазинилагароза прояв- 40 ляет свойства избирательно сорбировать гликозидазы и может быть использована для выделения, иммобилизации, концентрирования и очистки эти:: ферментов.

Ниже приведен пример получения 2-N-бензоиламидогептиламино-4-окси-Sym-триазинилагарозы.

II р и м е р. 1 стадия: 2,4-дихлор-Sym-триаэинилагароза.

К суспензии 25 мл сефарозы 4Б

50 (Pharmacia Fine Chemical s, Sweden) в .20 мл дистиллированной воды при интенсивном перемешивании и охлаждении (3 1 .С) прибавляют 1 г (5,4 ммоль) трихлортриазина в 25 мл 55 ацетона, доводят рН смеси до 8,5

0,5 1 М раствором едкого натра и поддерживают это значение рН в течение 3-10 мин. Об окончании активации свидетельствует резкое изменение рН реакционной среды в щелочную область (выше 9,0) от прибавления небольшого избытка 1 М раствора едкого натра.

Суспензию быстро выливают в равный объем холодной 25Ъ-ной уксусной кислоты, фильтруют и промывают на фильттре охлажденным 50%-ным водным ацетоном (100 мл) и дистиллированной водой (300 мл). Аликвоту полученного геля высушивают в вакууме над РдО до постоянного веса и анализируют.

Найдено, 4: С 44,21; H 5,02;

N 1,76, СС2,08, что соответствует замещению каждого 9-15 остатков галактозы в агарозе.

2 стадия". 2-аминогептиламино-4-хлор-Sym-триазинилагароза, К раствору 2 r (15 ммоль) гептаметилендиамина в 20 мл 0,7 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,8-9,0) прибавляют 25 мл 2,4-дихлор-Sym-триазинилагарозы. Смесь интенсивно перемешивают в течение 1 ч при 18 С.

Сефарозу отфильтровывают и промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции Фильтрата с нингидрином.

Найдено: 1 мл геля содержит 1020 мкмоль гептаметилендиамина.

3 стадия: 2-аминогептиламино-4-окси-Яутп-триазинилагароза.

Гидролиз 2-аминогептиламино-4-хлор-Sym-триазинилагарозы проводят 0,5 1<1 раствором карбоната натрия (рН 10,0

10,5) в течение 30 мин при 20ОC.

Найдено: отсутствие хлора.

4 стадия: 2-N- бензоиламидогептиламино-4-окси-Sym-триаэинилагароза.

К раствору 0,25 г (2 ммоль) бензойной кислоты в 2 мл метанола прибавляюT 25 мл 2-аминогептиламино-4-ок— си-Яут-триаэинилагарозы в 40 мл водного диоксана (диоксан: вода 2:3) и

0,8 r (4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 12 ч при 18< С, сорбент отфильтровывают и промывают 50%-ным водным метанолом (300 мл), 50%-ным водным ацетоном (100 мл) до отрицательного содержания в полученном геле дициклогексилмочевины и затем дистиллированной водой (300 мл). Получают 25 мл 2-N-бензоиламидогептиламино-4-окси-Sym-триаэинилагарозы.Методом титрования с тринитробензолсульфокислотой в геле.

»е обнару><еио свободных аминогрупп.

Формула изобретения

2-N- Бензоиламидогептиламино-4-окси-Sym-триазинилагароза формулы

IIII- Н

И О

660975

° @ФЬЮ

Ф 2 Ф. ф% I, где R — (СН, ), ЫНСОСб И„, как сорбент для гидро4обной хроматографии гликоэидаэ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Ег eC Z,Zaidenzaig 3.,Ы аИ1е0 S,H ätocarbon-соЫед Sep»aroses Use Ь the риг1Бсойлоп of gtscogenphosgor tose B1oc»

Biopsies кеь. Commun 3972,49; р. 38 ь.

2.Н1егМп S,Roseng еп J,pa»finnan $.,НМr op»oh(c 1п1егасЫоп с»готМодгар»ч.Т»е ээпМ1ейь апа Юе use о1 some aKk 3 апа агзВ derivatives о1 agarose. З.о1 С»гова1о roph3, 1974, 101, р. 281- 288.

3,АИЗиМоч A., ÌoéÎÆsî÷ N,HsdroP»оЬс йгота1ортарй of N-кем- -2-Иеxosannn dase. 3 о С»го пс 1оугор1 ч, 1977, 130, р. 451-453.

Составитель A Бочаров

P акто Л. УШакова Тех М.Петко Ко екто С. Шекмар

Заказ 2372/20 Тираж 512. Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,й-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4