Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 - трифосфатов

Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 - трифосфатов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскнх

Соцналнстнческнх

Республнк

<>660976 (б1) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 01.11.77 (21) 2538928/23-04 (5 1)М. К.

С 07 Н 19/16

fC 61 К 31/00 с присоединением заявки ¹

Государственный комитет

СССР яо делам изобретений и открытий (23) Приоритет— (53) УД((547. 963. . 32 (088.8) Опубликовано 0505,79. Бюллетень ¹ 17

Дата опубликования описания 050579 (72) Авторы изобретения

С. Н. Загребельный, В. А. Коржов, B. В. Хомов и A. Ф. Стариковская

Специальнс з конструкторско-технологическое бюро (71) Заявитель биологически активных веществ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУРИНОВЫХ

ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИД-5 — ТРИФОСФАТОВ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов, которые используются в биохимических исследованиях, например, для получения синтетических аналогов дезоксинуклеиновых кислот.

Известен способ получения дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов, заключающийся в фосфорилировании соот ветствующих дезоксинуклеозид-5 -монофосфатов в присутствии ионов М(з ацетилфосфата, аденозиндифосфата, цистина, очищенного ферментного пре парата (очищеннои ацетокиназы), выделенного из Escherichia coC (E.со6) и буфера трис- НСс при рН 7,5. Выход дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов 60-75Ъ в расчете на исходный 20 дезоксинуклеозид-5 -монофосфат (11.

Недостатками такого способа являются использование высокоочищенйого ферментного препарата (очистка которого требует многократного фракционирования выделенного из клеток

E cori фермента), что осложняет процесс, и относительно невысокий выход целевого продукта (60-75Ъ). 30

Целью изобретения является упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Цель достигается использованием в .качестве ферментного препарата цельного нефракционированногo экстракта из Е.coe MRE = 600.

Это позволяет избежать трудоемких стадии Фракционирования фермента и повысить выход целевого продукта до 80-82Ъ.

Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов согласно изобретению заключается в том, что соответствующие дезоксинуклеозид-5 -монофосфаты фосфорилируют в присутствии ионов hAg -", ацетилфосфата, в трис-НСе буфете при рН 7,5, используя цельный нефракционированный экстракт E.co84 HARE = 600 .

Выход целевого продукта 80-82Ъ.

Пример . Приготовление ферментного препарата.

50 г клеток с.соС1 AARON,,= 600 суспендируют в 150 мл 0,05 11 трис-НСс буфера (рН 7,5) и разрушают ультразвуком на ультразвуковом генераторе с частотои 18+0,4 кгц в течение 15 мин. Суспензию центрифугируют в течение 20 мин при 12000с), 660976

Формула изобретения

Составитель Л. Никулина

Р акто 3. Бо о кина Тех е >.Петко Кор екто И. Иуска

Заказ 2372/20 Тираж 512

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра шская наб. д 4/5

Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 надосадочную жидкость собирают и используют в качестве ферментного препарата. Концентрация белка в нем

14 мг/мл.

Ферментный препарат хранят в за.— мороженном виде при — 10ОС.

Синтез дезоксиаденозин-5 -трифосфата.

1500 мл реакционной смеси состава, мкмоль/мл: дезоксиаденозин-5 -монофосфат 10; ацетилфосфат 30, трис- 10 .НС6 буфер (рН 7,5) 40; ацетат магния

15; ферментный препарат 0,25 мг/мл термостатируют при 37 С в течение

2 ч. Реакцию останавливают прогреванием реакционной смеси в кипящей )5 водянои бане в течение 2-3 мин, .а затем быстро охлаждают. Образовавшийся осадок белка удаляют центриФугированием и надосадочную жидкость хроматографируют на ионооб- 20 меннон смоле Дауэкс 1х2 в градиенте

Li CC при рН 2,3. Фракции элюата, содержащие дезоксиаденозин-5 -трифосфат, объединяют и нейтрализуют гидратом окиси лития до рН 7,0. Дезоксиаценозин-5 -трифосфат осах<дают в виде литиевой соли охлажденной смесью этанол-ацетон (10:1).. Осадок собирают центрифугированием и лиофильно высушивают. Выход дезоксиаденозин-5 -трифосфата 82% в расчете на исходный дезоксиаденозин-5 -монофосфат.

Содержание основного вещества в продукте 94%, спектральные отношения, pd 2: Пало /Ваьо = О, 82, 35

02.go /Dying = 0,22.

1I р и м е р 2. Синтез дезоксигуанозин-5 -трифосфата проводят в условиях примера 1. Готовый продукт выделяют, как в примере 1. выход дезоксигуанозин-5 -трифосфата 80Ъ в расчете на исходный дезоксигуанозин-5 —

-монофосфат. Содержание основного вещества в продукте 99Ъ. Спектральные отношения, рН 2: Э /0 =1 04; йзо /В о = 0,69

Предлагаемый способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов прост в технологическом исполнении и может быть применен в промышленном масштабе.

Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов путем фосфорилирования соответствующих дезоксинуклеозид-5 -монофосфатов в присутствии ионов Mg +, ацетилфосфата, ферментного препарата, выделенного из

ЕзсЬегictricr сой, и буфера трисНС при рН 7,5, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве ферментного препарата используют цельный нефракционированныи экстракт из Езсйегictlicr

col?, lARE = 600.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Ьefrrnan 3.R,Bessrnan М.J-,Sin s Е.S-, Kornber.g А." Enzsnratic Ssntheз1з о Ýeîu Э

x>r ibonucEeic АсЯ - Л- BioK.СпеГп 233, 9 1, р. 163 (1958) .