Способ получения биомассы,обогащенной полинуклеотидфосфорилазой

Способ получения биомассы,обогащенной полинуклеотидфосфорилазой

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

>>>661006

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 08. 06.76 (21) 2370072/28-13 с присоединением заявки 1ч (23) Приоритет—

Опубликовано 05.05.79. Бюллетень № 17

Дата опубликования описания 25.05.79, (51) М. Кл.

С 12 D 13/10

Государственный квинтет

СССР по делам нэаоретеннй н еткрытнй (53) УДК577. . 15 (088.8) (72) Авторы изобретения

И. А. Шмите, Д. Э. Гравите, 3. А. Виестуре и М. P. Витенберг (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ, ОБОГАЩЕННОЙ

ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗОЙ

Изобретение относится к способу получения микроби Ibublx биомасс. обогащенных биологически активными веществами.

Известны методы получения биомасс с полинуклеотидфосфорилазной активностьн> из родов A7otobacter, Micrococcus, Pseudomonas, Aегоbacter, Proteus, Bacillus, Serràtia, Xar>thomor>as, Achromobacter, Escherichia.

Известен способ получения оиомасс из

Езсйегichia coli с полинуклеотидфосфорилазной активностью, предусматривающий использование Fscherichia coli с активностью -. 1 ед/мг белка (1).

Наиболее близким по технической сугцности и достигаемому результату является способ получения биомассы, обогащенной полинх клеотидфосфорилазой, предусматривающий культивирование бактерий Escher ichia co11 u > питательной среде, содержагцей псптоп 2О/р, глюкозу 0,2 /д, КНе РО.—

О,1 mM Х)агНРО4 — 0,1 mM (. Н )2 SO.—

02% M@SO,, — — 0010 „, FeSO4 -- 5 мгл.

Условия K >льтивированпя: рН питательной среды — — 7 4, темпер гаури 3>

Рез",ë üòaòû культивирования: выход опомассы (по сухому весу) — Зг/л, активность фермента — 0,88 м МР/мг белка ()

Нс.u>cTaTêaми известного процесса являстся ueдостаточно высокий выход биомассы, так как не обеспечивается в полной мере питание органическим азотом, и недостаточно высокая активность полинуклеотидфосфорилазы в биомассе; что обусловлено низкой продуктивностью штамма и тем, что питательная среда не обеспечивает достаточного углеводного питания, не обладает стабилизированной буферной системой и содер кит пон аммония, который подавляет накопление фермента в биомассе.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение выхода биомассы с повышенной полинуклеотидфосфорилазной активностью.

Поставленная пель достигается тем, что из штаммов Esche> ichia coli используют

gp штамм MRF — 600. а в состав питательной среды дополнительно вводят лимонную кислоту. гидролизат казеина и дрожжевой аКстракт, при атом;лк>козу, пептон и фосфа661006 ты берут в соотношении 1:0,02:1,66, а количество лимонной кислоты устанавливают равным 0.025% от обье(13 среды.

Предлагаемое техническое решение обеспечивает увеличение выхода биомассы, обогащенной иолинуклеотидфосфорилазой до

4,5 — 5 г/л, и повыв!ение активности фермента до 20 — 25сд/мг белка.

Использ >?!3?!Иый в качестве иродуцента штамм Е. coli МКЕ-600 является мутантом. не способным синтезировать РНК-азу 1 и

1О обладает повышенной способностью синтезиров3TI. ПНФ-азу.

Ц(тамм Евс11ег1СГ>!а col i МКЕ-600 получен из коллекции музейных культур Гос. контрольного института им. A. А. Тарасевича в 1972 г. H имеет следующу!0 характеристику, Морфология: палочки с размерами (1,5—

2,5) Х (0,3 — 0,6)р, грамотрицательны, coopbl lIe 06p3 3i!t0T, иодв!!ж?п>1. Фи»иo>70! 0-6НОхНМННс кие CBO!tcTB3: факультативный 3!! 1эроб, жела Гииу не разжижает, культура растет ня сиитсти >еских средах, иреиму!цествен0 испог!ьзу!От аммиачиый я»от, !.якже растет иа средах с пеитоиом, дрожжевым явТо,>iH33 o;>!, c?I. tрО>!?1:!ято:>! казеи!43, ct>060T,н?>(й аз(>-1- t(e> (>>?к> tp»e!

Отиош(H ie H источникам yt. tepn>13: cáp325

Ж И Р> 3 (. Т М 0 i l Π—, !Д! i И П 0,.1 и С 3 Х 3 Р ИД I>1, С Г! И РТ Ы И

Îpc3Hi! ?СCHH(Hi!C!!(> I Hi. И» (iOC !c i?I X C I360 !

4сиоль»">. (!!>» !3(H!!>. ю t ь!?:!Окамс?1?!ую кис-! .>IoT i, itp II("io i!> I >(.т,!имонн >>к> H яб 10>4H>, ю кислоты.

В процессе роста иггамм Образует аммиак, сс!>0?>О>?(цн> (, и!?дол, восстанавливает нит

РГ?т?. Д(> (!,;;»ИТО!>.

K>, Tура растет i ри рН 5--9, оитим>Гм

p1l р(>кта 6 — 7, ieмиература роста 30 — 37 С, имеет дезамииирук>и ие и дскярбоксилирукчIL,Hå способности.

Наряду с использованием нового штамма согласно предлагаемому изобретению в состав и>итатсльной с1зедь! В?!О!1??т лимонную кислоту как >шдуктор иолииуклеотидфосфорилазы и стабилизатор буферной системы.

Присутствие лимонной кислоты в пита-тельной среде влияет на реакции цикла трикарбоновых кислот клетки, таким образом сдвигая окислнтельные процессы клетки, косвенно вызывая усиление биосинтеза ПНФазы. 45

Лимонная кислота в питательной среде повышает растворимость солей магния и солей других двухвалентных металлов и тем самым стабилизирует фосфатно-буферную систему питательной среды, препятствуя образованию нерастворимых фосфатов и выпадению их в осадок. Таким образом, ионы магния и фосфатов становятся более доступными для питания клеток, что способствует приросту биомассы.

Стабилизированная буферная система предотвращает преждевременное подкисление питательной среды во время роста культуры и обеспечивает повышен?!ый выход биомассы.

Введение в иитагельную среду глюкозы, пептона и фосфатов в соотношении 1:0,02:

:1,66 оказывает значительное воздействие на дыхательную функцию, вызывая дисбаланс в синтезе макроэргических соединений фосфора и си итеза Р Н К.

Выращивание клеток ири низшей точке оптимальных температурных пределов роста, т. е. при 28 — 30 С, также уменьшает дыхательную активность клеток.

Снижение дыхательной активности вызывает повышение концентрации ортофосфатов в клетке и дегарадацию РНК в ней, что способствует биосинтезу и накоплению полинуклеотидфосфорилазы.

В питательную среду для обеспечения разнообразия органического азота добавляют также гидролизат казеина и дрожжевой экстракт.

Таким образом способ заключается в следуюгцем: в качестве иродуцента ПНФ-азы используют штамм Eschel ich,à coli NRE-600.

Для получения биомассы, обо! ащенной полинуклеотидфосфорилазой, культуру выращивают на синтетической питательной среде следующего состава:

Пеитон 0,1%

Гидролизат казеина 1 — 2%

Дрожжевой экстракт 01-02%

КНг РО4 25 — 30 mN

?"(яг НРО4 25 — 30 mN

N (>.SO4 0 025%

Лимонная кислота 0 025%

Глюкозу в кол и честве 4-- 5 /(> вводят в !!Итательную среду в виде стерильного раствора. Максимум биосинтеза иолинуклеотидфосфорилазы достигается к 6-ому час культивирования.

Результаты культивирования.

Выход биомассы 4,5 — 5,0 г/л, Активность ПНФ-азы 20 ед/мг белка.

После ферментации биомассу отделяют сепарацией и замораживают. В таком виде

ПНФ-азная активность сохраняется до 6 месяцев без потерь.

Пример 1.

В качестве продуцента ПНФ-азы используют культуру E. coli NRE-600.

Питательная среда содержит:

Пептон 0,1%

Гидролизат казеина 1%

Дрожжевой экстракт 0,1%

КНг РО4 30 mN

Хяг НР04 30 mN

NUTSO, 0 025%

Лимонную кислоту 0,025%

1% глюкозы вводят в питательную среду в виде стерильного раствора в начале ферментации, остальные 4% — к 4-му час ферментации, рН питательной среды поддерживают на уровне 7,5 — 7,6 при помощи

50%-ного раствора КОН.

66!006

Формула изобретс ни»

Составитель И. Привалова

Текред О. Луговая Корректор Е. flaw

Тираж 525 Подписное

Редактор И. Грязнова

Заказ 2389/24

ЦН И И П И Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал П П П «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Выращивание микробной биомассы E. coli МКЕ-600. Культура F. coli NRE-600 поддерживается на столбиках МГ1А под вазелиновым маслом, пересевается раз в год.

1. Выращивание посевного материала.

Культуру пересевают на косяки и выращивают 24 час, после чего культуру пересевают в колбу со !00 мл питательнои среды, инкубируют стационарно 10 — 12 час. Инокулят готовят, пересевая 10 — 12 час культуру на

800 мл свежей среды из расчета 1:!О и вырашивают на качалке при 37 С, 100 об/мин

3 час. 2. Ферментация культуры F.. col i

MRE-600 производится после добавления инокулята из расчета 40 мл культуры на л питательной среды. Ферментацию ведут при температуре 29 — 3! С в условиях принудительной аэрации (2л воздуха, л питательной среды) .

Во время ферментации контролируют однородность культуры, прирост биомассы, рН.

Выход биомассы — 4,5 г/л. Активность

ПНФ-азы — 25 ед/мг белка.

Лример 2.

Состав питательной среды:

Пептон 0 l o, Гидролизат казеина 2 /о

Дрожжевой экстракт 0,2",„

КН РО. 25 п1М

1х1аг Н РО, 25 п1М

MgSO, О 25о/о

Лимонная кислота 0,25 /р

Глюкозу в виде стерильного раствора вводят по 1% через О, 1,2,3,4 час культи- 30 вирования. Остальные операции осушествляют как в примере 1.

Выход биомассы — 5 г/л

Ак1ивность полинуклеотпдфосфорилазы

20 ед/мг белка.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает выход биомассы — 4,5—

5 г/л н активность полпнуклеотидфосфорилазы 20--25 ед/мг белка.

Способ получения биомассы, обогащенной пол и нуклеотидфосфорил азой, предусматриваюгций культивирование Escherichia coli на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, сернокислый магний и фосфаты, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы и интенсификации накопления полинуклсотндфосфорилазы, из штаммов Escheãгс11!а со!! используют штамм

MRE-6ОО, а в состав питательной среды дополнительно вводят лимонную кислоту, гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, при этом глюкозу, пептон и фосфаты берут в соотношении 1: 0,02: 1,66.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лимонную кислоту вводят в количестве

0,025 /р от объема питательной среды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

Мв 401667, кл. С 07 Н 22/03, 1973.

2. J. R. Wi!liams, М. Grunberg — Manago.

Polinu;leotide phosphorilase hautement purific 1 à partu de Е. coli. — «Biochem Biohys

Acta>>1964, 89, р. 66.