Штамм вниигенетика-4995,продуцирующий лизин

Штамм вниигенетика-4995,продуцирующий лизин

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Реслублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 30.09.76 (21) 2408876/28-13 с присоединением заявки М ив (23) Приоритет (51) М. Кл,2

С 12 К 1/02

С 1 2 D 1 3/06

Государстеенный комитет

СССР ое делам изобретений н открытий

Опубликовано 05.05.79. Бюллетень М 17

Дата опубликования описания 25.05.79. (53) УДК663.131:

:576.8 (088.8) (72) Авторы изобретения

Н. И. Жданова, IO. Д. Виханский, 3. М. Зайцева и Г. A. Удровский

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (71) Заявитель (54) ШТАММ CORYNEBACTERIUN GLUTAMICUM

ВНИИГЕНЕТИКА — 4995, ПРОДУЦИРУЮ1ЦИЙ I.-ЛИЗИН

Изобретение относится к микробиологии и касается получения штамма CorYnebacteгium glutaniicum ВНИИгенетика 4995, продуцируюп его 1=лизин.

1=лизин является одной из незаменимых аминокислот и широко применяется в сель- 5 ском хозяйстве для сбалансирования аминокислотного состава кормов и повышения их питательной ценности.

Известен пггамм Вгех ihacteriurn sp. 22A, продуцирующий 1=лизин (1).

Известен также штамм М1сгосoccus glutamicus Т вЂ” 3 (Corynebacterium glutamicum

T — 3) используемый для получения l=лизи(21, Однако для этих штаммов потребуется интенсивная аэрация питательной среды для максимального накопления 1-лизина. Эти штаммы способны продуцировать значительные количества 1=лизина только в тех условиях, где сульфптнос число нс ниже 4,0 г

O /ë «ac 20

Указанный уровень аэрации среды по техническим причинам не всегда может быть достигнут на существуK)nlè промышленных предприятиях, что, в свою очере1ь, ведет к снижению выхода продукта при использовании извс«стных п!таммов.

Кроме того. уровень накопления 1=лизина у известны. штаммов зависит от качества свекловичной мелассы, являюгцейся в данном способе основным источником углерода в питательной среде. В состав мелассы также входит некоторое количество ростовы. факторов и других веществ, избыток которых оказывает существенное влияние на уровень накопления лизина.

Количественное и качественное соотношение компонентов мелассы определяется многими факторами, главными из которых являются почвенные и климатические условия района выращивания свеклы, ее сорт и условия хранения, а также условия производства сахара. Следует отметить, что основным критерием оценки пригодности данной партии меaaccil для биосинтеза лизина является ее прямая биологическая проверка путем использования в питательной среде дзя выращивания штамма продуцснта и получення 1=лизина.

Цель изобретения заключается в создании штамма-продуцента I -лизина, который обеспечит стабильность уровня накопления

6()1013 лизина на производстве независимо 0Т степени интенсивности аэрации нитятелы!ой

СР(lhl И K(Т(33 HC f10.! ЬЗ < Е >(ой >>1(х 1 3ССЫ.

Новый штячм I!0 !у !али нутем ступ H I;1той селекции с нричене(!иехl (чутягена ((х(-мети..f-(х) -«If!p<>- "х -ни!р<> 30! 3;I «ki;(H «;I) из шта(чча (.Огу!)с ()(!< !. г(н!1! <>.JII Jdfl! Icнн! Т 3.

ОТооР f1 P0, (x IaTk3i3 fII>I x Bниженноч уровне аэрации с 1>c;(h i! ухьфит!н>е числс. — 2 г ()p, л. «3(! ) .

Б рсзультяте нроведения двух этапов сслекции получен Hfòя ч ч (.01 g Jlf(ckfl! Jc(IIII

ВНИИгенетикя-49!)5, кс> I орый нро (х !н!рус т

l3 О!!ТИ (ч H;I Ь(I Ы Х . (. I и I I 0 Õ0,3!I 0 I 0 III Г3 х(х! 3 3

ЧСЛОВИЯХ РЯВНОЕ С I!(IXI К01И>!ЕСТВО .(И:«! Н;I и не снижает -.TOT уровень в неблагоприятH hI Y,!. I H И <. X 0;11101 I f I T 3

H0IIH 5fH H If lf Н I I IC I! !3 f1<)(."I l l Э Ря (!, И JI. I H И< 110Л h:(О ВH!I I I И « II! I I 0. IX 0 iH! IIС i(>> М(х! Я С Сl>l.

II 1TH и (11 C Jl f3 1 сен (>;1,1!,I!0%I )t,, 3(C II p()fhlHl, !f. il!ihIX K<., 1hT3 р ио; !f0»!C )031 В 34;>. ! ((Г(!11<ч;!чс! 1 сг!С,г, !Oil(< i,::ряк! ри (иKX. . Чорфо. (ОГI IH. К,. I(Гки 013! I, I hkfl>l< . KOpOT KH( (О,(> 1,2 чк} оессl,Op0è, с, I рячноло>кительныс, неподвижны< .

К>.ifhòóp;k,pf III>i(и фи:<но,l(>l и !Сск!I(признаки.

Мясо-;i(нт<>н:!Ый ягяр (ЧI!Л). Колонии н; седьчь(с с,!K!t рос.!.,i,(иях(с гром 2,0

3,0 х!ч, кру!11ые, к(>ай 1,1:1;кий, !и.нтр IlplfH О Д Н Я Т Б B k f Д С K 0 I l Ч С 1, I I < i !3 (Р Х Н О С Т Ь С P H . i l!3.(ьн ы (ч и ><1(x f J< 1 б<х 1ы и .

Р0сТ шт() llx» н; B f Of)l,и сутки умс ренный, KP

IIлоскии, блс ск .. „,н,!н. Нн< I белый. (.реля ГГ!01< (.: 11;! Ссдьмыс сутки р0сТН

o0ðHHx ет ко.l .:: I,I;I)IO i p011 0 7 - 1,2 ч м, кр, глые с Iля !«: Kf>

I I ()0($>(I l h ô(Pl l С < И II, I I <> B< f) X H(i(ТЬ 1,1 i;(KH H, <), н>стH f>i f!H, .Нв(»! бе, I I l lt РO("I и! (pl 1 x;J на 13TО()ыс. (. 3 TKи x fkfcРс I!I!h!(1, I.,)« I! 1,1<1, (KIHI, 1l<)B(J)xНо(I h I,.1 1.(K 3 5l. IIPO($) kf. (Ь I I, 0(K i l k!. О, И (K I >> С К, Ц>1 И, I(J)! Т ()(I hill, I,-1Я роСТ<3 ?? (((II 3 жля е<, 51 fs биолине, гс>;!<и3ерин (и.l!t чегlfÎllllfl(I PC0HÈHC), ll: Î,! (1liIIII(и и;!. IHII(»

Мо, (око H(С13<. f) Гhf f3

Кяртофсль 11;1 чеп)ерт! !с 3 к!(!Нтрих белого 1(13! 13, игчент 13 с рсдс .<и и!дег!Яе

Желятину не р.. э>к(кяе!

Отнон!ение !i liс Г<:!Никам х I и. ро,()!. Л<сНМН,1!fJ>óåò Глк>! с> :у ч я н иолу, я (и г;! !н!1 ри я

ИЛИ cIXf)IOIfkt0 ИСНОЛЬЛ) Е Э! ИЛОБЫй

cHIIpI, :и н,: О.il> )! т,!(!к!Олу. () (НОН!С НИС K:, ОЧИ((ни . ((.301!И. I IIPX (1 (С () НОНН< i i!!t, 10(>kt(I i>ll! И. Ill < 3<> ГНОКИСЛЫ и и Ч Ч«Н >! <Н>:l(. ВИ(! Ч.

> (нжс Н,И,((1;Н3. 1(Hi>l ;1 КО.Н! ЦЫ С РЯ i I I lfтельных л< ин>!>я IOpH! ix иены г;IH!fJf ис хо,(но! и штах!(!(! 1 3 >< HOBOI() lx"ã I!IT!!Oã0 штяч,i;I

ВНИИ(снетнка 4995.

Г1итатег(ьные c(,0,1hl содержат в качестве источника у! !cðî.за х!Слассу (22 >p), в качестве исто lllHK3 ростовых факторов кислоти>!й (среда 1) или ферментативный (средя 2) I и,1ролнзяты ВВК. (ВБК вЂ” кормовые дрожжи, 110, (х чен(! ы(Н3 3 ГлсвО 10 pOдях н(ф— ти ), к0,1ич(ство нерво! 0 и !)торо! 0 J,0P>p и

2,()<"... (110 (у.хох!х весу) OOTB(TcTB(íHî, ccðfl0KI1c, I ый ) и м(ГI (2,0 > <> )

Р<13личн< интенсHBHOcTh аэрации соз,(310 Г ИХ 1(. Х! f3<3 f)i>H PO!33HH H 00 hE)<33 к(И НИ тятс,(ьllÎ!1 среды в ко 103K. 11î!Jûøåíèÿ уровня аэрации (OcTHI 3(от использованием колб со сте!.;!янными отбойниками. Как следует из нриводимых данных, новый !Нтамм

ВI(ИИгенетика- --4995 itpH paHI«>jj интенсивности аэрации среды имеет одинаково высокий уровень някси!ления I -лизина, KHK llo яосол нотной концентряци и нродукта, так и

II0 х дег!Ьной продуктивности. Исходный нпямч 3 накапливает наиболынее количество лизина только в условиях высокой аэрации срс,(ы и резко снижает 1)ыход ли:3!If!if при ухудшении указанных условий. Новый штях(х! образу T меньшее чем ис.<одный

illò I)txi количество оиочассы, и имеет более

l3hf(. (! 3 Io i 3(.! ûfx Io НР((< к! инно(Гь (Г 1изи25 ня ня г биочяссы). .((явные, нредставлс нные в табе!Ице,1, нокя hll3;i!oT, ITO новый ц)(а(ям ВНИИгенетиК3 4<)с)5 ичеет высокий уровень накопления

1:.Iltлиня ня сре1е ¹ 1, содержа! (ей челас3() f >I и 3 т р ех Г) я 3 н ы х о Ол я с т(. и с т р

K3к ис,оцный ипячм Т 3 ичсс I высокий х Ровс нь т0;IhKO НЯ о, i!f0I IHHHJ>!x сн>ря:(iiов мслясс. Кяк свидстс,if>cffkxf0! данН Ь!Е I Ok! ж(THh НЯ Кои l(.!1(f R . I ki 3 li iI <1 > НOI!01 fl< f I Xi стн и! ко!!!и н Грани (! рос OBhlx фякп>ров 13 сре.и (в (klянязOH(. к0i l(l!. . 1 l исходно! < Итам31

Оных ф;!и Of)013 нрии>.(!Il и рс:(кочу снижеill l K) 13l>I X0Ë3 1.-,!и:3!l! I

t1як<н1леннс лилHI!3 и биомяс ы 3 штачгн>Б Т 3 и БН!(1!гснеп!кя 4()с)5 llpH разныхх x c,10!31!5lx

<к> ь(!x! колб 250 м23; скорость вращения качалки 240 об чин нродс)лжительность фер45 чс нтяни и 72 I ) II()ltfkc;L(IJO Б T;J()ГН(!(е 1.

113ко!(лсl!kf! лизина у штаммов T — 3 и

БI(ИИ<енс!3!ка --4995 нри разных условиях аэрации сре,(ы Л>> 2 (28 Г; объем колб 750 !ч; скоросп врящс ния качалки 240 об(чин; про с) д<, I 5k< i I 11> I f 0< "f I, (J>C p X„ l I и, », < 2 ч ) l l f) J I B(. е ! н> и Г>ол и ц(2.

Быхо.i .!и «iii;i у нгга!Ячя Т вЂ” 3 и ВНИИГе-! и Гнкя 4!>95 на среде X 1, содержащей (челясс) pHзли (ных партий и различные кон55

Ii; H ãpHfiiiH )0cT0f30f 0 фактора (КБВК-кислот-! но! > И.(рос!Г!антс! белково-витями(<ного кони< iiTp Г !) 12 - (:; объеч колб 250(я; скор<>с Гh 13p/л !ас при везено в табл и це 3.

1,0 (по сухому весу)

2,6

2,0 (с!я при готовлеп и я гидрол изя та 10% смспеII31151 БВК в 4 х Н О)„а!зтоклавир1 ется при 128=С в тсчсние 2,5 I, нейтрализуется аммиаком и добавляется в питателы!ую среду из расчета 1% БВЕ . (по сухому вссу) . .ВмеcT(с необходимыми ростовыми фа ктора 3! 11 I!(Iи испо,1ьзо вс! II II II гllдр01 и затя

БВК вносится необходимое количество сульфата аммония (2,6%):

Вода водопроводная рН сред! доводят при помощи Х!!ОН

Таким образом предполагаемый новый 5 мутантный штамм ВНИИгенетика — 4995, полученный путем ступенчатой селекции из штамма Т вЂ” -3, отличается от после,знего способностью накопления большого количества лизина (около 40 г/л) при пониженной аэрации среды (сульфитное число 1,0— !

О

3,0 г Ог/л.час ), более высокой удельной продуктивность!о лизина на единицу биомас сы (2,9 — 4,1 г/г), более стабильным выходо . продукта при использовании различных партий мелассы и различных концентраций ростового фактора в среде, меньшим размером колоний и белой окраской штриха и колоний на средах МИЛ и Гловера.

Полученный новый штамм «ВНИИгенетика — 4995» с указанными отличительными признаками создает предпосылки для осу- 20 ществления стабильного процесса производства L-лизина в промышленных ус 10BHBx независимо от колебаний уровня аэрации (в широком диапазоне сульфитного числа от

1,0 до 3,5 г О /л час !) и независимо от применяемой партии мелассы, которая может

25 быть получена с различных сахарных заводов.

При,!!ер 1. Культуру штамма ВНИИгенетика 4995 выращива!от в течение 1 сут в пробирках на скошенной агаризованной сре- зо де МПА. Выросшую культуру с косяков петлей переносят в колбы емкостью 250 мл, содержащие 30 мл посевной среды. Состав посевной среды (вес.%): мелясса — 3; кукурузный экстракт — 3; NaC I — 0,4; рн -- 7,2.

Засеянные колбы инкубирук>т на качалке (220 — 240 об/мин) в течение 18 — 24 ч при температуре 28 С. Выращенный таким образом посевной материал R количестве 5% от объема ферментационной среды инокули40 руют 13 ферментационную среду следующего состава (Всc. /p):

Мелясся 22,0 (по сахару 1 1,0%)

Кислогный !идролизат дрожжей (БВК) 45 (!х1Н ) SO;

Мел срерментацию проводят в колбах Эрлен мейера (емкостью 250 мл), содержащих 10 мл среды, на качалке (240 об/мин) при 28—

30 С). C1ëüôèTíoå число при указанном объ ме соеды сnc»nляет 3,0 г О /л час . После !

ЭО (2 Ч В КуЛЬтураЛЬНОИ жндКОСтн НаКаПЛИвается 39,6 г/л лизина. (Исходный штамм

Т- 3 в тех же условиях накапливает

28,3 г,л лизина).

При,1!ер 2. Способ выращивания посевного материала тот же, что в примере 1. Отличие состоит в составе ферментационной среды и условиях ферментации.

Ферментационная среда содержит. вес.%:

Меласса 22,0 (по сахару 11,0 !p)

Ферментативный и!дролизат дрожжеВых к,1РТОк 2,0 (по сх хомх весу) (lUH4)2SO, 2,5

Мел 2,0

Вода водопроводная рН среды доводят

ХаОН после стерилизации до 7,2 — 7,5

ФермеHTdlllIIo прово1ят в колбах Эрленмейера (емкостью 750 мл). содержащих 75 мл среды. на качалке (240 об/мин) при 28—

29 С. Сульфитное число при данном режиме аэрации среды составляет 1,0 г О /л час .

После 65-- -72 ч в культуральной жидкости накапливается 33,4 г/л лизнна (Исходный штамм Т 3 в аналогичных условиях накапливает 17,4 г л лизина).

При.1!ер 3. Способ выращивания посевного материала тот же, что и в примере 1, условия фсрментацпи как в примере 2. Отличие в составе ферментационной среды.

Ферментационная среда содержит, вес.о, р.

Мелясса 22.0 (по сахару 1 1,0",p)

Кукурузный экстра кт 3,0 (сырой вес)

ХН, Cl 3,5

К: НРО. 0,1

Мел 2.0

ОН среды как и в примере 2

Г1ослс 72 ч ферментации в культуральной жидко Tè накапливается 22,7 г/ë лизина. (Исходный штамм Т вЂ” 3 в аналогичных условиях накапливает 13,3 г/л лизина).

При.!!ер -/. Способ выращивания посевного материала, состав сред тот же, что и в примере 1. Отличие состоит в условиях ферментации.

Ферментацию проводят в металлическом ферментере (емкостью 20 1), содержа!цем

12 л среды. Лэрацию питательной среды осуществляют путем подачи воздуха с объемной скоростью 1 объем воздуха на объем среды в минуту при скорости вращения х!ешалки 700 об/мин. Данный режим аэрации соответствует сульфитному числу 3.2 г Ог, л ° час. .

Накопление лизина ll биомассы (в ср;1Впении со штаммом T — 3) на 72 часа фермен тации указаны в табл. 4.

66!О!3

Таб ница l.

Улепьная проуктивность, Усповия аэраци

I !тамм о лас супьфитное бъо лизина чиспо, гО >/и час

/п биомассы

2м.

2 > 85

13,3

1О > > 0

1 2, О

3,0

Т вЂ” 3

1,, I>0

20!

)I3I! i I> онетика-:1995 >О

30 1

3,2О

М в указанных вариантах опыт >в нсн>:пьз >наны копоы с тбойникамн.

Таб ница 2

Усповия аэрации сроцы:

Еонцентра>ц>ия низина в г/и

, ),7

T-3

1 Ij, 3

ВНИ! !генетика-4095

31,2

31,0

3 -, .I! >> с1 ()

:реды 25 мп Объем о гное число (супьфи

/л -час " ) 1,5 гО

ЗЬ,1

26,3

i&,3

3,30 1(>

5 мл испо> с ) 661013

Табпица3

Партия 1

0,75

34,0

32,0 (ВеселоПополянский

1,00

38,0

40,0

35,0

20,0 сахарный гзавод, Киевская область) 1,25

1,50

37,0

28,6

0,75

l,00

Партия 2 (Т имашевский сахарный завов

) 5

18,0 .14,0

10,0

26,0

32,0

32,0

30,0

1,25

),;)0

Краси опарский край

Партия 3 (А дыгейс— кий c ix m—

О 75

),00

),25

),75 3,С

"5,0

"G,0

24,0

30,0

34-, 0

36,0

38,0 н ый:за во п ) Т аблица 4

2,9

36,2 12,0

ВНИИгенетика-4995

1,9

28,4

14,0

Т-3

Формула изобретения

Штамм Corynebacterium glutamicum

ВНИИгенетика — 4995, продуцирующий 1=лизин. Хранится в Центральном музее промышленных культур, регистрационный ¹ В-345.

Морфологические признаки. Клетки, короткие овальные, 0.6 — 1,2 мк, бесспоровые, грамположительные, неподвижные.

Культуральные и физиологические признаки. Мясо-пептонный агар (МГ)А) . Колонии на седьмые сутки роста диаметром 2,0

3,0 мм, круглые, край гладкий, центр приподнят в виде конуса, поверхность с радиальными мелкими бороздками, цвет белый.

Рост штриха на вторые сутки умеренный, 45 край гладкий, поверхность гладкая, профиль плоский, блеск тусклый, цвет белый.

Среда Гловера. На седьмые сутки роста образует колонии диаметром О,/ — 1,2 мм, круглые с гладким краем, центр приподнят, профиль сферический, поверхность гладкая, блестящая, цвет белый. Рост штриха на вторые сутки умеренный, край гладкий, поверхность гладкая, профиль плоский, блеск тусклый, цвет белый.

Для роста на минимальной среде нуждается в биотине, гомосерине (или метионине и треонине), изолейцине и валине.

Молоко не свертывает. Слабо подщелачивает.

661013

Составитель М. Ларина

Редактор Г. Кузьмина Texpeä О. Луговая Корректор F. Папи

Заказ 2389, 24 тираж 525 Подписное

ЦН И И П И Государс венного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж- 35, Раугоская наб., д. 4!5

Филиал ППП «Патент», Ужгород, ул. Проектная, 4

Картофель. На четвертые c), TKH нггрик белого Ii,âåòÿ, пигмент в сре1, не выделяет телятину не рязжижаез

OTIIo "HåíJJå к исто:HHKHì углерода. Ассимилирует глюкозу, сякярозу, мяльтозу, ксилозу, галактозу, !я!(но!у, яцетат нагрия или A !Jìîíèÿ. Слабо использует этиловый спи рт. Не ис ио.(ьзует л а ктозу.

O T J! o JkI c I I J! (. K !! с то и н и к я т! я! 3 от а . А с(и и и ли руст с!. рHoK и с,:1 ь; ll, х. 1ористы H ll.lè IJ 30TII(! кислый яммоний и мо !евину.

11)тяу!м «В))ИИг(петина- -4!99!!» способен

TH E!II.lIiIIo ня к!! 1!л:! вать,. I!! 3HII f oKo!Io 40 I,, I

Н(1 СРЕ (11,(, CO. Iaaf!/К и ill И К ll К(1 (Е(ГВ(OCIIOH нык комно!Г(!Ит(i!I .!еляссу и источники ро(тов! !х фактопoH (K!Jc,lo3ный или (реру!ентятивныA гт!дролизят дрожжевык клеток или и) hóð)k3Hûé экстракт) при низком уровне аэрации среды (сульфитное число 1,0— 3,6 г 0 )л час !). Имеет высокую продуктивность лизина на единицу биомассы (2,9—

4,1 г лизина, !. биомассы) и обеспечивает стаон Ik Hoc нак(н!ление продукта при использовании различных партий мелассы и повыи!енных концентраций ростового фактора в среде.

Источники информации, принятые во внимание нри экспертизе

1. Авторское свидетельство ." А 240644, кл. С 12 0 13/06, 1968.

2. Авторское свидетельство Ао 213032, кл С 12 D 13/06, 1966.