Способ получения антигенно измененных вируса гриппа

Способ получения антигенно измененных вируса гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Реслублкк, ОЛ ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

< >661018 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 22.02.73 (21) 1897261/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М.К .

С 12 К 7/00

Государственный начтет

СССР па делам нзооретеннй н открытнй (53) УДК 615.45:

: 576.858 (088. 8) Опубликовано 05.05.79. Бюллетень № 17

Дата опубликования описания 15.05.79 (?2) Автор изобретения

Г. С. Скрипченко и А. Г. Власова

Одесский научно-исследовательский институт вирусологии и эпидемиологии им. И. И. Мечникова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННО ИЗМЕНЕННЫХ

ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГРИППА

Изобретение относится к области медицины и касается вирусологии.

Известен способ получения антигенно измененных вариантов вируса гриппа путем введения в куриный эмбрион иммунной сыворотки к вирусу гриппа и вируса грипйа с последующей инкубацией и выделением целевого продукта (1).

Однако такой способ не позволяет вызвать повышение иммуногенности и стабильные изменения свойств у различных штаммов вируса гриппа.

Целью настоящего изобретения является стабилизация иммуногенных свойств вируса гриппа.

Для этого куриные эмбрионы предварительно пассивно иммунизируют изологичной иммунной сывороткой по всем подтипам вирусов гриппа и затем через 24 — 28 час вводят вирус гриппа. Вирус гриппа вводят в дозе 10 — 10 ЭИД (эмбриональных инфекционных доз) .

Способ осуществляют следующим образом.

Изологические иммунные сыворотки вводят в эмбрион в определенные сроки (не менее чем за 24 час до введения вируса) .

Этот прием обеспечивает равномерное распределение антител в жидкостях и на поверхности чувствительных клеток куриного эмбриона, в силу чего антитела могут воздействовать на вирус не только в фазе адсорбции и прикрепления к поверхности клеток, но и в фазе выхода вирионов из них. Этот прием предотвращает проявление феномена разведения. Для введения в эмбрион используется смесь иммунных изологических сывороток к представителям всех подтипов вируса, циркулировавших до выделения направленно изменяемого штамма.

Цель этого приема — предотвратить реверсию свойств вариантов в сторону штаммов-предшественников и направить изменение свойств по пути, близкому естественному процессу изменчивости. Вирус, который подвергается направленному воздействию, 2е вводится в пассивно иммунизированный эмбрион неразведенным, т.е. в систему вносится 10 — 10 ЭИД.

Этот прием позволяет вводить в пассивно иммунизированные эмбрионы весь набор

661018 частиц, из которых под влиянием антител сохраняют свою активность наиболее жизнеспособные или атипичные по сравнению с основной массой варионов исходной популяции. 5

Контроль дозы сыворотки в пассивно иммунизирс<ванном эмбрионе осуществляется: по уровню антигемагглютининов в жидкостях эмбриона непосредственно перед введением вируса; Ilo силе их нейтрализующего воздействия в пассивно иммунизированном эмбрионе через 48 — 72 час после введения вируса.

Изменение свойств вируса (повышение или понижение er о иммуногенности) регулируется количеством введенной в эмбрион сыворотки, которое контролируется по вышеуказанному методу, а так)Ke кратностью воздействия иммунными сыворотками.

Пример. 3.. Отбор штыммов вируса и получение изологических иммуHHhlx chlBopoток.

Изологические иммунные сыворотки (петушиные) готовят по методу Smedel к изменяемому вируcу и пр(<ставителям вирусов-предшественников. Например, если изменяемым вирусом является штамм А2 Гонконг<<1<68, то почимо э.гoi U вируса для иммунизации петухов используют предшестве<шики: АО (свиней), ЛО (Шкл), Л! (Пын, Скандинавия), А2 (Сингапур, Одесса, <1енигнад) H;iH другие, бл:<зкие Hxl по cBQHcтвам штаммы. ЗО

II. Пассивная ичмуниза<<ия куриных эчбрионов 9 в 10 дневного срока инкубации, выбор и контроль дозы их<х<уflHhlx сывороток в эмбрионе.

Ко<<центрация антител в жидкостях эмбриона должна приближаться к «фоновому» уровню антигемагглютининов к вирусам-пре,< шественникам в chlBOpoTKBx крови люд(lt.

При этом, однако, э.»;ор 30HB;thlthle жидкости должны содержать антитела в титре не менее 1:10.

Заданную концентрацию антител в пассивно иммугп<;I poBa..i:it ix эмбрионах получают при в ie;!eHHè количества сыворотки, которое определяют путем предва рител ьных расчетов, исх<>дя из титра сывороток и усредненного веса эмбриональной жидкое- 4s ти и эмбрио Ia с оболочками. Правильность расчетов контролируется определением уровня антигемагглютиниilnB в жидкостях эмбрионов через 24- 48 час после пассивной иммунизации и «ыращивания в термостате.

Например, для того, .-<тобы в жидкостях эмбрионов антигемагглютинины содержались в пределах титров !:10--1:20, в каждый эмбрион вводят по 0,16 мл изологической сыворотки с титром специфических антигемагглютининов 1:1280. Через 24 — 48 час инкубации и последу<ощего охлаждения титры антител в жидкостях при контрольном определении в реакции торможения гемагглютинации (РТГЛ) составляют от 1:8 — 1:! 6.

Заданная концентрация антигемагглютининов в жидкостях эмбриона является исходной. Поскольку было установлено, что концентрация сыворотки в пассивно иммунизированном эмбрионе определяет свойства селекционируемых вирусов, то последующие этапы работы предусматривают контроль ее содержания не только по уровню антигемагглютининов в жидкостях эмбриоНОВ, но и 1lo силе их нейтрализующего воздействия на вирус.

„ .),Ля того, чтобы осуществить указанные контроли, отбирают количество сывороток, необходимое для пассивной иммунизации 20 эмбрионов. Сыворотки смешивают. В каж<ый из 10 эчбрионов вводят 1<>20 часть приготовленной смеси. Оставшук>ся смесь сывороток разно.<5<Т изотоническим раствором

II0I3e! pc IIIIoH со 1Н с коз

48 (ыс пассивно ич,1(lрчоз>пь 4 гемагглютинирующие е IHIiHlil ГЛI. изменяемого виру(и) Каждым разведением счеси сывороток

lI 1м>> и Из и р",1О Г IIO 1 0 э. lорИОИОВ.

Чеp(>3 24 H I H -18 и<<С IIO о эм бр<30<<о в, KOторыч оыли введеllt i рызли <ные разведения

chII3Op0T0K, BcKpt>it);»0T. ii B РТГЛ c )KH IKOCтью каждого эмбрионы определяют содержание ынтHI å÷Hãã iK)THIIHIIOB к изменяемому ви(>чсу и вирчсым-lip(д>пественникыч.,)Кидкости контролируют 1акже на стерильность.

I l l. Зарыжение пассивно иччунизированиых куpHiltlx эмори<шов. Опрсде.<ение режимов с(лекции и соотв<тствии с задачачи исC.Л (.:I 0 E3 I l < И и .

Оставшиеся эчорионы (Ilo 5 эчбрионов, пассивно иччуIIHÇHp013;t titlhix неразве;<енных<и сывороткачи и сыворотками B разведеiIH5Ix) 3BpBH«II0T 0,2»л цельной вируссодержы!цей жи,<кости и>мсняс",lol о Ви р; < и (в каж;ц><й эм<>рион вводят 2. !О 2.10 - эх<бриональtttix инф<кционн lx;!Oз >И, 1 изме11 51 (. Ч О Г 0 Б И P " С с> ) .

Зараженные пассивно иммунизированные эмбрионы через 48 72 <ас инкубации при

35 — 36 С охлыждык) <, вскрывают и исследх Io1 B реакции гема(глютинации (РГЛ) с ! o взвесью эритроцитов кур. Контролирук>т на бактсриальнуK) стерильность. я Из лишенных бакзагрязнения жидкостей пассивно иммунизированных зараженных эмбрионов готовят смеси (смесь состоит из жидкостей эмбрионов, пассивно иммунизиp0BBBiibix каждым разведением сывороток) .

Смеси эмбриональных жидкостей, соответствующие разведениям сывороток, контролиру>от на содержание вируса методом предельных разведений. Г!ри отсутствии инфекционной активности неразведенного материала его пассируют трехкратно на куриных эчбрионах неразведенным.

661018

Форл1ула изобретения

Составитель В. Головин

Редактор !l. Грязнова техред О. Луговая Корректор М. Пожо

;;a:iаз 2300!25 тираж 525 Подяисное

ЦН ii H П И Государственного комитета CCCF по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4, 5

Филиал П ПП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Последующие воздействия сыворотками на изменяемый вирус проводят, исходя из задач исследований.

Получение вариантов.

В случае необходимости получения на конечных этапах вариантов со сниженной иммуногенностью и изменившимися антигенными взаимоотноц1ениями. для последуюilLHx воздействий применяют концентрации сывороток, которые снижают инфекционность изменяемого вируса в пассивно иммунизированных эмбрионах в сравнении с вирусом, пассированным в «нормальных» эмбрионах, в 10 — 10 раз, т.е. при последующем пассировании на куриных эмбрионах материала из зараженных пассивно иммунизированных эмбрионов вирус удается выявить в следующих случаях: а) остаточная инфекционность проявляется при разве21енин жидкости в 10 раз; о) вирус узнается выявить B неразведенной жидкости пассивно иммунизированного за1ражгннсго эмбриона; в) инфекционность вируса проявляется на 2 — 3 пассаже в курином эмбрионе. (Первый тип возд Йствий ) .

В слу-IBC Hcoox03HxfocTH получения ваpHBliToB вируса с повышенной иммуногенностью, Bhlcoi oA ре„родуктивной и гемагглютц11ИРМ1О1ЦС11 антИВНОСтЬЮ, Стнм»ЛИРУЮЩ. Х

1ри иммуниBBIIHH образование антител с оо,.1ее широким спектром реагирования, чем исходllhlii виру,, для последующих воздейс; Bi;l! применяют концентрации сывороток, которые снижают инфекционную активность

Hзх1ен11емо1о вируса ii пассивно иммуHHBHðîзанноч эмбрионе в 10- — 10 раз. (Второй

1. -;и во:-..сйствий) .

После î l!Io! o пассажа на куриных эмбриoilBx вирусы, подвергшиеся воздействиям

КаК ПО ПЕРВОЧУ, таК И liO ВтОРОх1У ТИПУ, ВОСстанавливакгг инфекционную и гемагглютинирук>щую ак ивносгь, при этом инфекционная активность IlpH последующих пассажах становится более высокой, чем у исходного вируса.

После;1ассажа HB куриных эмбрионах вирусы подвергают повторному воздействию сыворо1ка»! в пассивно иммунизированных эмбрионах coогветственно по пеовому и ВТорому ти.1) .

Прове)эяют инфекционную активность вируса 1н1сле Bго|.отo воздействия в 11ассив1 .о

f ЧМ НИЗИПОН lflf!o«l Кмон!1ОЧ Э ilO "iHO!IC.

При воздействиях по первому типу в случае повышения остаточно: инфекционной активности для куриных эмбрионов изменяемого 51.руса после второго пассажа

5 более чем в 10 раз, дозу иммунных сывороток, вводимых B эмбрион, увеличивают до подавляюц, и инфекционную активность в

10-" — 10 раз.

По второму типу — воздействия проводят установленной первоначально дозой.

Свойства полученных вариантов проверяют c:foxlo!..I,BIo общепринятых методов.

Количество воздействий иммуннь1ми сыворотками в пассивно иммунизированных эмбри",нах проводят в соответствии с поставленной задачей.

Повышение иммуногенности происходит после 1-го — 3-х воздействий как по первому, так и по второму типу. Последующие воздействия по Iicp!io»iy типу резко снижают иммуногенность вируса (по антителобразованию в течение 2 — 3 недель после иммунизации). При этом снижается также авидность вируса и изменяются его антигенные взаимоотношения с исходным вирусом и родственными вариантами.

Второй тип воздействий, помимо повышения иммуногенности. вызывает стойкое повышение репродуктивной и гемагглютинирую1цей активности популяции вируса и вызывает образование антител с более широким спектром реагирования в РТГА.

Зо

1. Способ получения антигенно измененных вариантов вируса гриппа путем введения в куриный эмбрион иммунной сыворотки к вирусу гриппа и вируса гриппа с последующей инкубацией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью стабилизации иммуногенных свойств виру40 са гриппа, куриные эмбрионы предварительНо пассивно иммунизируют изологичной HMмунной сывороткой по всем подтипам вирусов гриппа и затем через 24 — 48 час вводят вирус гриппа.

2. Способ по и. !. отличающийся тем, что вирус гриппа вводят в дозе 106—

10 ЭИД

Ис-.очники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. ЖМЭИ, 10, 1954, с. 44.