Способ получения водорастворимых комплексов ферментов класса оксидоредуктаз

Способ получения водорастворимых комплексов ферментов класса оксидоредуктаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАЙИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ (IID )4 ме»

Союз Советских

Социалистических

Республик (51) м. к.2

С 07 G 7/02 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Завалено 3009.76,2() 2408226/23-04 с присоедииеиием заявки М

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий, Приоритет

Опубликован@ 15.05.79. Бюллетень N918 (53) УДК 577, 15.

° 07 (088. 8) Дата опубликования описания 1505.79 (72) ASVQPbl . И. В. Березин, A. М. Егоров, A. П. Осипов, НЗОфЕт@МИй Я. A. Александровский, Ю. Э. Кирш, В. А. КабаноВ .и Т. С. Лебедева р ) дай@итЕЛ Московский ордена Ленина я ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. В . Ломоносова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОЛОРАСТВОРИМЫХ КОМПЛЕКСОВ

ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ОКСИДОРЙДУКТАЗ

Известен способ получения иммобилизованных ферментов, когда в ка честве водонерастворимого носителя используют сополимеры диметилацеталя

N-акриламиноацетальдегида и Н,N -метиленбисакриламида (2).

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, а именно к способу получения иммобилизованных на водооаствори..мых полимерах ферментов класса оксидоредуктаз, которь-е мсгут быть, использованы в проточных реакторах мембранного и колоночного типа, а также в автоматических анализаторах биологических объектов. Стабйльные ферментные препараты, иммобилизованные такиМ способом могут найти йри- . менение в медицинской и пищевой про, мышлейности, в тонком органическом синтезе, при создании преобраэова-. телей химйческой .энергии в электрическую, а также в охране окружающей среды.,/

Известно, что иммобилизация фер.ментов .на различных твердых носителях, а также образование комплексов с водорастворимыми полимерами позволяет увеличить продолжительность действия ферментов,и обеспечивает их технологичность (1). Особые трудности при иммобилизации встречаются ,:в работе с оксидоредуктазами (например оксидазами метанола, глюкозы, .различными видами дегидрогеназ).

" Нестабильность этих ферментов в иммо-30

2 билизованном состоянии затрудняет разработку способов их использования в различных областях народногО хозяйства;

В настоящее время одним из основных способов получения иммобилизованных ферментов, в частности оксидоредуктаз, является их пришивка к носйтелям содержащим свободные альдегидные группы. При этом происходит образование ковалентной связи между свободными аминогрупйами фермента или его сульфгидрильными группами и альдегидными группами носителя. Важнейшей характеристикой приготовленных таким способом ферментов является величина остаточной актйвности и стабильность. Как правило, происходит значительное падение активности, а стабильность иммобилизованных ферментов повышается. Абсолютные значения этих величин зависят от вида используемых носителей и ферментов.

662557

Недостатком укаэанного. способа

" яв»л»яется значительная потеря актйвности ферментов при иммобилизации.

Так, в случае трипсина сохраняет 25% начальной активности, а при иммобилизации оа -амилазы эта величйна сос-тавляет всего лишь 1-4%. 5

Из других полимеров, содержаших свободные альдегидные группы, следует отметить сополимеры стирола и акрилового альдегида (3), а также 10 сополимеры винилиновых эфиров акриловой кислоты — вакрил и кованакрил t4).

Недостатком укаэанных методов является большая потеря активности фермента при его иммобилизации, достигающая в некоторых случаях 90,% и более. Кроме того, стабильность фермента часто лишь незначительно возрастает при такого рода иммобилиз ации.

Известен также способ получения водорастворимых комплексов ферментов. класса оксидоредуктаз, в частности глюкозооксидазы, заключающийся в обработке раствора фермента 25 растворами водорастворимых полимеров, с поливинилпирролидона, полиэтилейоксида, сополимера винилпирро лидона и вйнйлацетата (5). Получен ные таким образом комплексы фермен- 30 та с полимером сохраняют высокую начальйую активность (до 90%), однако стабильность их лишь в 2-3 раза превышает стабильность нативных ферментов. Кроме того, отсутствие кова-, ц лентнйх-связей между молекулами фермейта и- полимером делает образовавшиеся комплексы непрочными и . не йоэволя»ет эффективно исйольэбвать жх в технологических процессах. - 40 . . ЦеЛью описываемого способа является йовышение стабильности ферментов с одновременным сохранением высокого уровня ферментативной активности.. указанвая ц, достигается за счет — 45 . того, что в качестве водораствори мой полимерной подложки для иммобилизации ферментов класса оксидор@цук- таз используют кватернизованные синтетические водорастворимые полимеры на основе 4-винилпиридина и акролеина, содержащие альдегидные группы, Т особные взаимодействовать с сульфd дрильными и аминогруппами ферментов с образованием прочного ковалент- 55 ного комплекса фермента с полимером.

Согласно изобретению описывается способ получения водорастворимого комплекса ферментов класса оксидоредуктаз с повьваенной стабильноСтью.и 60 высокими, качествами в смысле техно,логичности использования полученных препаратов путем обработки ферментов водорастворимым кватернизованным сополимером акролеина с 4-винилпиридином, содержащим альдегидные группы.

Процесс получения иммобилизованных описываемым способом препаратов является двухстадийным и его проводят предпочтительно следующим образом.

1. Получают в дорастворимый полимер, являющийся сополимером акролеина и 4-винилпиридина. Эти сополимеры могут содержать 5-. 30% акролеиновых звеньев. Для придания этим полимерам растворимости в воде их кватернизуют любый алкилирующим агентом, например диметилсульфатом. Степень кватернизации можно варьировать от

20 до 95% пиридиновых звеньев.

2. К раствору фермента с рН 4-10, преимущественно 7-8, добавляют раствор кватернизованного сополимера акролеина с .4-винилпиридином. Becohoe соотношение полимера и фермента в растворе можно варьировать от

1:1 до 30:1, при этом лучше исполь» зовать раствор, содержащий кофакторы или субстраты фермента. Добавление полимера приводит к образованию прочного ковалентного комплекса с ферментом, сохраняющего .высокую каталитичзскую активность и обладающего повышенной стабильностью. Данный .способ йозволяет с большой простотой получать водорастворимые стабилизированные ферменты, которые могут быть с успехом использованы в проточных реакторах мембранного типа.

Преимущество полимер- ферментнйх комплексов такого типа заключается в том, что благодаря присутствию . с»вободнЦ альдегидных групп в полимерной цепи, не вступивших в реакцию:с ферментом, комПлексы могут быть легко иммобилизованы на различного типа макропористых твердых подложках, содержащих свободные аминогруппы (например аминосиланизированные кремйезеьы). Кроме того, наличие кватернизованйых йиридйновых колец, несуцих положительный заряд, позволяет проводить адсорбционную иммобилизацйю полиферментных комплексов на -твердых носителях, имеющих отрицательный заряд (например пористые стекла). Специфический эФФект стаби- лизацин активности ферментов, содержащих сульфгидрильные группы, сополимером акролеина с 4-винилпиридином может быть обусловлен также способностью пиридиновых колец связывать в растворе ионы металлов, каталкзкрующих необходимое окисление сульф-: гидрильнйх групп.

Пример 1. 10 г 4-винилпиридийа растворяют в 50 мл диметилформамида, содержащего 10 мг азобясиэобутиронитрила в качестве инициатора полимеризации и добавляют 1 .мл свежеперегнанного акролеина. Раствор заливают в ампулу и откачивают воздух.чапаянную ампулу помещают в термостат (60 С) и выдерживают 5-6 ч.

Полимер осаждают диэтиловым эфиром.

662557

5 6

Выход продукта 7 r. Содержание акро- мент = 1:1). Смесь выдерживают при

- леиновых звеньев, определенное окси- комнатной температуре 30 мин. Оста. мйнированием и по HK-спектрам (при точная активность фермента после обдлине волны Л - 1715 см 1, соответст- разования комплекса 95%. Исследо вующей валентным колебаниям С - 0 вана с;абильность полученного комгруппы), составляет 20% ° плекса в присутствии 0,3 М формиата

5 г полученного сополимера раст- 5 натрия при 37 С. Нативный фермент воряют в 10 мл этанола и добавляют в присутствии 0,3 М формиата пол2 г диметилсульфта. Реакцию проводят ностью теряет активность через 500 ч

Р при комнатной температуре в течение а комплекс сохраняет 50% активности

1 сут. Продукт осаждают диэтиловым через 800 ч и около 20% через 12000 ч. эфиром. Содержание кватернизованных 10 Пример 4. К 3 мл раствора пиридиновых колец определяется по . глюкозооксидазы (KФ 1.1.3.4) конПМР-спектру или по HK-спектру (ис- центрации 1,7 ° 10 +М, содержащего польэуется соотношение интенсивнос- p 1 М КМ < РН 8,0 добавляют ти полос при длинах волн Л -1600 см - Раствор сополимера акролеина с 4-випиридиновое кольцо и д — 1640 см 1 - 15 нилпиридином (203 альдегидных групп, кватернизованное кольцс(, и состав- 50% алкилирования, Мол. вес около ляет 50 Ъ. 45000) концентрацией 4-10 M . Смесь

Пример 2. К 2 мл раствора вццерживают при комнатной температуФормиатдегидрогеназы (КФ 1 ° 2. 1. 2) ре в течение 30 мин. Остаточная акн (мол. вес. 96000) с удельной актив- тивность фермента после образования

0 3-10 М в остью 5 ед/мг и концентрацией комплекса 100%. Исследована т р е мов фосфатном буфере с РН стабильность глюкоэооксидазы в раст7 0 содержащем НАД в концентрации воре при температуре 60 С и РН 5,6..

10 мг/мл, приливают 2 мл раствора Из Раствора отбирают пробы по 50 мкл сополимера акролеина с 4-винилпири25 и добавляют к 1 мл раствор D дином (20% альдегидных групп, 50% козы концентрации 10 м в фосфаталкилирования, мол. вес 45000) кон- ном буфере РН. 5,8. Активность опцентрации 9-10 М (соотношение. : Ределя от .вольтай1теРометрическим ме« полимер: Фермент = 30:1). Смесь: вы- тодом,.измеряя убыль растворенного держивают при комнатной температуре кислорода в пробе кислородным

30.. элек..мин. Остаточная вктивность фер- S0 тродом кларка при температуре 25 с мента после образования комплекса 90%. и РН 5,8. Активность расчитывают па

: Исследована стабильность Формиатде- . линейному участку графика зависигидрогеиаэы в растворе в фосфатном мости "тангенса угла наклона измеФУФере при температуре 30 с в отсутст- нения тока от времени . Определяют

:вие каких-либо добавок, в присутствии 35 константы инактивацин первого понг/мл НАд и в комплексе с поли- Рядка нативного фермента и ф рмента мером в присутствии 10.мг/мл .НАд+:. в комплексе с полимером. Соответс

Из раствора отбирают пробы цо 0,1 мл, вующие значения составляют 7,8 ° 10 мин добавляют в кювету, содержащую 0,7 мл и 4 10 .мин 1 . Таким образом, стаФфосфатного буфера РН 7,5, 0,1 -; "--.- 40 сильность фермента возрастает приблираствора НАд+ концентрации 10 мг/мл зительно в 20 раз. и .0,1 мл 3 М раствора формиата и измеряют скорость реакции окисления Мрмула изобретения

Формиата, за которой следят спектрофотометрически Во образованию Вос 1. СпОСОб пОлучениЯ Войораствори

Фтановлениой формь| НАд Н при ине мых комплексов Ферментов класса ок-.45 волны 340 нм. Определенй константы - сидоредуктаз путем -обработки Ферменинактивации нативного фермента в тОВ ВОДОРаСтВОРЯВЫМИ ПОЛйМЕРаМИ присутствии 10 мг/мл НАД+ и ко - л и ч а ю шийся тем что с лекса фермента с полимером в прй- Целью повышениЯ стабильности ФеРмен"

+ „ 0 50 тов с одновременным сохранением высоСоответств т щие значения равны 3,2.10- кого УРовня ферментативной активнос-. мин и 3,0-10 мин . Как видно из .

-1 Ь ти, а также с цельМ повышения тех« этОгО пРимера, стабильность фермента нологичности использования водораст4ПОВЙШается примерно в 90 раз. . воримых комплексов Ферментов, в ка55 честве водорастворимых полимеров ,П, Р " M е Р 3- К 2 мл раствора Фор- используют содержащие альдегидиые мИатдегидрогенаэы (К Ф 1.2 1 2) мол. вес. 36000 (К Ф 1.2.1.2), .: . группы кватернизованные сополимеры акс удельной активностью ролеина с 4-винилпиридином.

15 ед/мг и концентрацией 2 ° 10 М в . 2. С тЬсоб по и. 1, о т л и ч а юу ере р,, содержащем, 0 шийся тем, что фермент и .полимер формиат натрия в концентрации 0,6 М, берут в соотношении 1:1 - 1:30 цо приливают 2 мл раствора сополимера весу. акролеина с 4-винилпиридином 20%

М р д ом (20% Источники информации, принятые во альдегидных групп, 50% алкилирования, внимание при экспертизе 2 ° 10 Ф мол. вес около 45000) концентрация, . 1. Йммобилизованные ферментЫ

М (соотношение полимер: фер- . под Ред И В Б ерезина> В . К. Анто7 б нова, К. Иартинека, изд. ИГУ, 1976.

2 Л.4р1оп,J U.McLar en, Т, Н.Тhornas, Car

bahgdrate Res., 22, 30, 1972.

3. Патент ФРГ 9 2104810 кл. ба 22/10, 1971.

4 Е Згоап 4 Racois Ernpfoi des чапаеву Кь dans derives de С ur ease insofub3es dans 3 åan. Те1r a hedron Lett., 50, 5077, 1972.

5, Патент СШ7 Р 3860484, кл. 195/б3, 1975.

Составитель. А.. Ьочаров, Рщактор л. емельянова тнкряя 3.Фанта. корректор о.конянская

Заказ 2639/29 Тираж 512 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035аКоскна iK-35 Ратшская нан.. 4 5

4илиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4