Аммонийная соль этилового эфира -аминоизобутилфосфонил5 - аденилата для ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке и способ ее получения

Аммонийная соль этилового эфира -аминоизобутилфосфонил5 - аденилата для ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке и способ ее получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<н662558 (61) Дополнительное к авт. свыд-ву— (22) Заявлено 180777 (21) 2508263/23-04 (51)М. Кл.

07 Н 19/20

//A 6.1 К 31/00 с присоединением заявки Но (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 150579. Бюллетень Nо 18 (Д) УДК 577. 159 (088. 8) Дата опубликования описания 1705.79 (72) Авторы

НЗОбр8тЕНИЯ A. И. Бирюков, Т. И. Осипова и P. М. Хомутов

Институт молекулярной биологии AH СССР (54) АММОНИИНАЯ СОЛЬ ЭТИЛОВОГО ЭФИРА (6 — АМИНОИЗОБУТИЛФОСФОНИЛ-5 -АДЕHHJIATA

ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА

БЕЛКА В КЛЕТКЕ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

0н К 15

Изобретение относится к новому способу получения нового. соединения,— аммонийной соли оо -аминофосфонил-5 -аденилата общей формулы

5 для ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке.

Указанное вещество является ингибитором переноса валина на транспортйую рибонукленновую кислоту (тРНК), Наличие же заместителя у атома фосфора позволяет использовать это соединение в изучении топографии активного центра, а также для получения необратимых ингибиторов ферментов.

Известны смешанные ангидриды метилхлорметил-(1) и N-хлорацетиламиноме тилфосфоновых, кислот (2) и аденозин,-5 -монофосфата (АМФ). Известные смешанные ангидриды в своем составе содержат не свободную, а защищенную аминогруппу, что препятствует использованию последних для иэбирательноно и эффективного ингибирования ферментов.

Цель изобретения — синтез нового соединения, аммонийной соли этилового эфира о6 -аминоизобутилфосфонил-5 -аденилата, отличающейся от известных смешанных ангидридов строением фосфонатного фрагмента, что поз- воляет использоватЬ это соединение как ингибитор процессов биосинтеза белка в клетке - достигается путем синтеза последнего.

Известен метод получения смешанных ангидридов под действием сильного конденсирующего средства дициклогексилкарбодиимида (2). Однако этим способом трудно получить целевой продукт из-за необходимости дополнительного введения и снятия защиты функциональных групп, что очень усложняет процесс при наличии лабильной ангидридной связи в смешанном ангидриде..

Поставленная цель достигается путем использования актнвированного фосгеном этилового эфира oG -аминоФормула изобретения

3 6625 ц. изобутилфосфоновой кислоты и взаимодействием последнего с солью аденозин-5 -монофосфата и третичного амина. . Описываемый споссб получения аммонийной соли этилового эфира ж -амихоизобутилфосфонил-.5,-аденилата заключается в том, что активированный фосгеном этиловый эфйр с6 -аминоизобутилфосфоновой кислоты подвергают

"" взаимодействию с солью аденозин-5 -.

-монофосфата и третичного амина. 10

Пример 1. Смешанный ангидрид моноэтилового эфира c6 .-аминоизобутилфосфоновой кислоты и аденозин-5 фосфата.

В суспензйю 0,09 г (0,5 ммоля) г5 моноэтилового эфира с6 -аминоизобутилфосфоновой кислоты в 6 мгг абсолютного диоксана пропускают фосген до полного растворения эфира (3-5 мин), реакционную смесь упаргвают в вакуу ме досуха и повторяют операции растворения в диоксане (3 мл) и упаривания в вакууме трижды. Раствор остатка в 3 мл аб"олютного диметилформами да прибавляют при перемешивании к раствору 0,315 г (0,45 ммоля) три-н-октиламмониевой соли аденозин-5 —

-фосфата в 3 мл абсолютного диметилформамида. Спустя 2 ч при 20-22 С реакционную смесь упаривают в вакуумег при 40-.42 С остаток растирают с эфиром, образовавшийся осадок отфильтровывают и вещество выделяют пре паративной хроматографией (восходящая, бумага ФН-18, система изопропа- нол: 25%-ный аммиак: вада — 7:1:2; 35 полосу c1gy -0,43 элюируют водой при

4-4,50С и злюат лиофилизуют), Выход аммонийной соли смеш. нного ангидрида моноэтилового"эфира с6 -аминоизобу тилфосфоновой кислоты и аценозин-5 — .- фосфата 45:, =0,43 (система см. выше}, 0 „ =-1 (бумага ФЧ-18, 0,05 М ацетаг натрия рн 4,1 напряжение

4000 В) адьо Ь3520 (РН 7), на zpoматограммах и электрофореграмйах йог- 45 лощающее в УФ-свете пятно окрашивается нингидрином. Продуктами гидрслиза вещества (1н. НС8, 100 С

5 мин) являются аденозин-5 -фосфат и моноэтиловый эфир сб -аминоизобутилфосфоновой кислоты. Вещество окисляет-+ ся перйодатом, что свидетельствует о сохранении цис-гликольной группирови, а УФ-спектр его соответствует ектру незамещенного по ядру аденозина. 55

Вещество тормозит реакции пирофосфатного обмена и аминоацилирования тРйС, каталиэируемые валил-тРНК-синтетазой из Е., соО В, в концентрациях порядка 10 ь — 10 м. (К 2,7 10 b@.g)

-Ь ь 5

8,2 10 для реакций,аденозинтрифосфата (АТФ) — пирофосфатного СФ< обмена и аминоацилирования тРНК соответственно), что близко сродству валиладенилата, основного промежуточного соединения ферментативной реакции.

58 4

Пример 2. Ингибирование валил-тРНК-синтетазы аммонийной солью этилового эфира д -аминоизобутилфосфонил-5 -аденилата.

Валил-иРНК-сг.нтетазу получают и очищают известными методами.

При определении активности фермента используют ATC Na-доль, С -L-валин (125 Кюри/моль), Р -пиро,фосфат натрия, активированный уголь, P -"меркаптоэтанол коммерческой чистоты, которые применяют без предварительной очистки.

Ингибирование реакций аминоацилирования тРНК и ФФ; обмена проводят в стандартных условиях при 37-37,5 С в. течение 15 мин. 50 мкл (3 ° 10 5-108 и ) раствора этилового эфира с -аминоизобутилфосфонггл-5 -аденилата вносят в инкубационную пробу непосредственно перед добавлением фермента.Инкубационная проба содержит в пересчете на 1 мп: 40 мкмолей мрш"НС1. (рН 7,8),5 мкмолей ацетата магния, 72 мкмоля хлористо(о аммония,6 мкмо лей, Р-меркаптоэтанола,2 мкмоля .,:АТФ, 4 мкмоля . С -1.-валина, 0,3мг тРНК и, 0,005 мг феРмента. Скорость ацилирования тPHK определяют известными методами. АТФ-ФФ обмена определяют в стандартной инкубационной смеси, содержащей.в пересчете на 1 мл: 100 мкмолей гаже НСг. (рн 8,0), 5 мккмолей ацетата магния, 72 мкмоля хлористого аммония, 6 мкмолей jb-меркаптоэтанола, 2 мкмоля L-валина, 2 мкмолч Р -пирофосфата натрия и 0,02 мг фермента. Анализ проб проводят известными-методами. Получают константы ингибирования для" АТФ-ФФ(. К1 (М) 2,7 10 а для аминоацилирования К1 (М) 8, 2. 10

1. Аммонийная соль этилового эфира гб -аминоизобутилфосфонил-5 - аденилата общей формулы

QR 6E для ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке.

2. Способ получения соединений по п. 1, отличающийся тег., что активированный фосгеном в органическом ргстворителе этиловый эфир ж -аминсгизобутилфосфоновой кислоты подвергают взаимодействию с солью аденозин-5 -монофосфата и третичного амина.. Составитель Л. Никулина

Заказ 2639/29 1ираж 512

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113

Подписное и35 Москва Ж 35 Ра ская наб. д. 4 5

Филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная, 4 г:*;. -« ««-:а . . зъммФм Ъ ь..3t.-"«.«. ;.::- . ° -,.;, . =, . -. «.-ь,:.::.=-..-.азьей т... -: ..-. - .... ° % -.,:.. Юй

Б 662558 Q

Источники инФормации, принятые во 2. Гуляев Н. Н., Гуницкая Л. В., внимание при экспертизе Баранова Л. A. Нестерова М. В., 1.3.С.Mgere and I..Ì.6 mon,"The Ggnthe- Муртуэаев И. И., Северин Е.С., Йссле»

sic о1 5 -МеоуРцР Nethglphosphonafe ond дование структуры активного центра ка5 -Adengfg8 ChEorornethgfphosphonate,k О . талит:;ческой субединицы гистонкиназы, Chem. 80,442 (17б5). Биохимия, 41 У 7 (1976) с. 1241..