Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИКАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ "663724

Союз Советсних

Соцналистмиесних

Республнн (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлеио06.10.72 (2! ) 1835325/28-15 с присоединением заявки Рй (23) П риорите»! ссударстввнньа нсйнтат

СССР

IIo делам нзобрвтнннй н отнрытнй

Опубликовано 25.05,79. Бюллетень М 1«9

Пата опубликования описания 28.05.79 (53) УДК 615.779.

° 9(088.8) Иностранцы

Вернер Флек, Дитрих Штраус, Вольфганг Кох, Петер Крамер и Хельмут Праузер (ГДР) (72) Авторы изобретения

Иностранное предприятие

"Феб Иенафарм" (7!) Заявитель (rap) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

2 вида Ыгер1оппсея viotacehsl МЕТ

3А 6844 в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержашей источники углерода, азота и минеральные соли при аэрации и перемешивании с последуюшим выделением целевого продукта иэ культурельной жидкости, очисткой и хроматографическим разделением его на активные компоненты. Способ отличается тем, что в качестве продуцента целевого продукта используют штамм Str" ертотпъсев bioÑñòñÅïâ

1 МЕТ 3А 6844 а культивирование проЬ водят при 25-37 С в течение двух-шести дней.

Штамм коллекции штаммов Центрального института микробиологии и экспериментальной терапии в г. Иена при Немецкой академии наук в Берлине под номером

1 МЕТ JA 6844. Исходныи тип был выделен в 1958 г. из пробы земли местности Швелленбург в районе Элькслебен (Эрфурт). Штамм принадлежит к виду

Ыгер1отпусев и соответствует Ыгер т,оптн1(1а Kacens (России-Дорив, 189 l, Кра- .

= -»«.» ..Ъ.," -»"» --- .» -»«- -.-. -»» =: - —. - —.. -«к»»«

Изобретение относится к способам получения антибиотиков с концеростатической и вирусостатической активностью, точнее к способам получения антибиотиков с использованием в качестве продуцента вида St eptom ceS ч ойосепв

Известен способ получения антибиотика путем культивирования Stveptorn ces

siotacehs 1212 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, 10 азота и минеральные соли, при аэрации и перемещивании с последуюшим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, очисткой и хромвтографическим разделением его нв активные компонен15 ты. Однако получаемыи антибиотик недостаточно активен против микроплаэменных, вирусных и опухолевых болезней (1!.

Целью изобретения является получение нового антибиотика виоламицинв, активного против микроплазменных вттрусных и опухолевых заболеваний.

Способ получения антибиотика заключается в том, чтб кулътивируют продуцент

» «».

r û i I A i Ë l r ö r

2 - (5i ) М Кд.--"----- (С 12 К 9/14

663724 г сипьников, 1941, Ваксман, 1953), даваемому соглвс}}о исследованию штамма нового типа 1 SP 5082 (3MM Л вЂ” 1, R3A 656, в

ATCC 15888) в международном проекте и

М}фр1о тасеяйирлинга и Готтлиба (3ntT. м

Sash.React.19: 497, 1969). т

Культивирование штамма 1 МЕТЗА п

6844, квк и его мутантов и вариантов, т осуществляется в аэробных условиях.

Леофильно высушенный с землей споровый материал штамма приливают в соответству- Е ющие питательные вгаровые среды, а за- н тем ь жидкие, предварительно стерилиз6- ц ванные питательные среды, а образовавн шийся мицелий культивируют общеизвест- T

}5 ным методом при температуре в пределах н о о

25 и 37 С (предпочтительно 28 С) в в продолжение 2-6 дней (предпочтительно э

4 дней) при кислотности, которая к начв- л лу ферментационного процесса находится ш в пределах рН 6,2 и 7,0, а к концу26

Ф между 7,5 и 8,3. Питательная среда сос- р тоит из источников углероде и азота, а также из неорганических солей, В качестве в источников углерода могут применяться р

И крахмал, глюкоза, глицерин, маннит, декст- и рин, сахароза, соевое масло и соевая мука. E} качестве источников азота, помимо н упомянутых .аэотсодержвших: субстратов, ф могут применяться также сухие дрожжи, эе мясной пелтон и каэеин.

Штамм обладает следующими свойствами: субстрамицелий на различных.средах и в различные отрезки времени быва35 ет окрашен в красный, фиолетовый или синий цвет. Пигмент, который может дифундировать и в агаровые среды, облада.ет свойствами индикатора: в кислой сре- . де он красный в щелочной — синий. Воз-

40 душный мицелий окрашен в бледно-розовый, розовый или серовато-розовый цвет.

Споровые цепочки расположены в более или менее равномерной (в большинстве случаев открытой)спирали нв частично длинных главных гифах, Caopoaas поверхность колючая. Нв пептонсодержащих, а.также не тирозинсодержащих средах пигмент, обладающий цветом от коричневого до темно-синего, диффундирует в. агар, Штамм растет на бвзальной среде с добавкой д-глюкозы, ларабинозы, д-ксилоэы, м-имозита, д-миннита, д-фруктозы, рамноэы, сахароэы и рафинозы.

И

Выделение антибиотика виоламици}}а проводят следующим образом (см. схему).

Антибиотик экстрагирует из культурвлього фильтратв органическим, не смешиающимися или мало смешивающимися, а з мицелия органическими, смешивающиися с водой, растворителями. Иэ экстракв мицелия антибиотик реэкстрагируют с римененным для экстрвгирования кульурального фильтрвта несмешивающимся ли малосм еш ивающим с я растворителем соединяют с соответствующим экстраком культурального фильтрата. Полученый таки}} образом экстракт снова конентрируют, антибиотик переводят в водяую фазу и при рН 3,0-9,0 (предпочтиельно 8,2) снова экстрагируют с оргаическим, несмешивающимся с водой, расторителем и осаждают из концентрата кстрактв посредством смешения с петроейным эфиром или бензином при перемеивании освобождают от растворителя ильтрованием. Осадок растворяют в хлооформе, фильтруют от нерастворимого осадка, раствор хлороформа промывают одой и в заключение смешивают с петолейным эфиром, причем осаждается фрвкия А виоламицина, Фракцию А виоламицина растворяют в иэших спиртах, очищают на хроматограической колонне, например, с применением

Сефадекса (R) товарный знак фармации

Уппсвла (Швеиия) и разделяют на.полученный сначала виоламицин A и на полу ченный из колонны биологически неактивный агликоновый комплекс виоламицина

А.

Фракцию В виолвмицина получают из промывочной воды экстракта хлороформа, который подвергают экстракции при рН

6-9 в бутаноле. Экстракт концентрируют и смешивают с петролейным эфиром, причем осаждается фракция В виоламицина.

Ее растворяют в низших спиртах, очищают в хроматогрвфической колонне с применением Сефадекса (R) и отделяют полученный сначала виоламицин В, полученный затем виоламицин В}}, а также полученный последним биологически неактивный агликоновый комплекс виоламицинон B.

Виоламицины А, B и В различают по содержанию соединений сахара и могут быть разделены хроматографией на бумаге на шесть различных компонентов. Гидролизаты различных виолвмицинов дают одинаковую вгликоновую смесь, однако, с количественным отличием отдельных компонентов.

663724

Получение антибиотика ВПОЛАМИПИПА

Экстрагирование с органическими, смешиваюшимися с водой растворителями

Экстракт Т

Экстрагирование в водной фазе

Экстракт I I

Экстракт П

Экстрагирование с органическими, не смешиваюшимися с водой растворителями

Экстракт Ш т

Экстракт IiI

Реэкстракт

Осаждение с петролейным эфиром или бензином

Сырой продукт виоламицин

Растворение в хлороформе

Раствор виоламицина в хлороформе

Промывка водой

Органическая фракция А виоламицина

Смешивание с петролейным эфиром

Сырой продукт виоламицина А

Растворение в низших алифатических спиртах

Очистка на хромотографической колонне

Виоламицин А виоламицинон А

Антибиотик вноламицин A представляет собой комплекс аморфных красновато-коРаствор .виоламицина А (льтурлльный фнльтрнт (КГ) Экстрагирование с органическими не смешиваюшимися или мало смешиваюшнмися с водой растворителями

Экстрагирование в вод *ой фазе

Экстрагирование с органиче(кими, не смешиваюшимися с водой растворителями .

Водная фракция В виоламицина

Экстрагирование с бутанолом

Бутаноловый экстракт фракции3

Смешивание с петролейным эфиром

Сырой продукт виоламицина В

Растворение в низших алифатических спиртах

Раствор виоламицина В

Очистка на хроматографической колонне

Ииоламицин В виоламицинон В ричневых веществ, он хорошо растворим в хлороформе, ацетоне и спиртах, мало

663724

Мчсорбавгпа аИ вер Мсо штамм 56

О,ОЭ

0,15

0,76

0,76

%3copfos a

МогМюв

0,15 0,15

19,0

0,76 растворим в бензоле и не растворим в эфире и воде. Виоламицин А обладает свойствами индикатора и в кислых растворах обладает красным, а в шелочйых растворах синим цветом.

Как свежие ферментационные бульоны образователей виоламицина, так и выделенный из них антибиотик, подавляют рост грам-положительных бактерий и микробактерий, в меньшей мере они подавляют е рост представителей грам-отрицательных ,бактерий, с другой стороны, дрожжи и грибки не испытывают антибиотнческого

° 4 действия. Против плацентарных клеток 1И чЖ о (в пробирках) и против эксйериментально вызванных опухолей у мышей виоламицин проявляет цитостатическую, а также канцеростатическую активность.

Исследования канцеростатического действия антибиотика виоламицина.

На первой ступени канцеростатического теста (отдела экспериментальной терапии Z МЕТ, Иена) вйоламицин--сырец проявляется на мышах, которым были введены экспериментально лейкемии L 1210 и ЬATl, а также саркома 180 (активность в отношении саркомы 180). При однократном введении 5 и 2,5 мкг виоламицина-сырца на 20 r веса мыши затормаживается рост твердой опухоли по сравнению с необработанным контрольным

Приведенные в таблице результаты показывают, что виоламицин A является бактериостатически более активным itpoтив М.gaHjsept cvtn (Штамм 96), чем виоламицин. В, зато виоламицин B проявляет более сильную бактерицидную активность против M,11ùð16 ëS, чем виоламицин A. Оба виоламицина отличаются от известных до настояшего времени природ экземпляром на 48,9 и, соответственно, на 53,6%.

Бактериальные вирусы, как и представители вирусов у животных, приостанавливают свой рост под влиянием внутриклеточного проникновения антибиотиков без одновременного блокирования обмена вешества клетки-хозяина. Особенно сильную активность оказывает виоламицин на деление клеток и на обмен вешеств в состоянии покоя у видов микоплазмы.

Исследование бактериостатического и бактерицидного действия антибиотика виоламицина на микоплазмы.

Действие антибиотика проверяют на двух наиболее видных возбудителях эпизотии в сельском хозяйстве, в особенности в животноводстве и скотоводстве. Виоламицины A и В отличаются поразительной по силе бактериостатической и одновременно с этим и бактерицидной активностью в отношении hhscoptustna ц аРАльер"

4icum (штамм Д 6) нhhwcopGasrna Фцо"

PtltrnS. Сравнительное исследование биологической активности антибиотического комплекса вноламицина A и В. Проявляет при оценке теста разбавления на питательных бульонах следующий спектр действия (см. таблицу). ных материалов, обладающих активностью против микоплазмы; своим в сотни раз оольшим бактерицидным действием. Подобная биологическая активность против представителей микоплазм, которые могут вызвать болезненные симптомы у домашних животных, еше не была описана применительно к антрациклиновым антибио;тикам, что является особенно ценным.

663724

Пример 1. Два сосуда с прямым горлышком емкостью 500 мл содержат по 80 мл следующей культуральной среды, вес. С :

Глюкоза 1,5

Соевая мука 1„5

Хлористый натрий 0,5

Углекислый кальций 0,1

Первичны и фосфорнокислы и калий 0,03

Водопроводная вода Остальное. о

Стерилизация: 35 мин при 110 С.

После стерилизации рН 6,9.

Культуральную среду в сосудах с прямым горлышком инокулируют споровой и мицелиевой суспензией, полученной со стериальным иэотоническим раствором в поваренной соли культуры-обраэователя виоламицина в возрасте 10-14 дней, выращенной в пробирке на следующей питательной среде, :

Овсяная мука 1„0

Овсяные хлопья, молотые 1„0

Агар-агар 2,0

Водопроводная вода Остальное. о

Стерилизация: 35 мин при120 С, естественная кислотность.

Выратценные культуры выдерживают в течение 48 час при 28 С в приборе при встряхивании (180 об/мин). 8 мм полученной таким образом культуры служат для инокуляции одного сосуда с прямым: горлышком, в котором содержится 80 мл следующей среды, вес. :

Глюкоза 2,0

Соевая. мука 2,0

Хлористый натрий 0,5

Углекислый кальций 0,3

Водопроводная вода Остальное. о

Стерилизация: 35 мин при 115 С.

После стерилизации рН 6,3. Температура о во время ферментации 28 С, частота встряхивания 180 об/мин.

После 72 час ферментации достигаеч ся наивысшее содержание виоламицина

125 мкг/мл. Определение активности осуществляют известными способами.

Пример 2. 80 мл указанной в примере 1 жидкой среды, содержащейся в сосуде с прямым горльпцком на 500 мл, инокулируют штаммом-продуцентом виоламицина. из питательной среды, как описано в примере 1. Культивируют в течение 24 час при 28 С в приборе при о встряхивании (180 об/мин). 12 мл полу ченного таким образом питательного бу" льона служат для инокуляции 400 мл та1S кой же среды предварительного культивирования, содержащейся в двухлитровой стеклянной колбе.

Культивируют последующие 24 час при 28 С и при встряхивании (180 об/

/мин), полученные таким образом 400 мл культурального бульона служат для инокуляции 20 л среды, описанной в примере 1. Эта среда содержится в 32-литро вом стеклянном ферментере. Во время

10 ферментации, которая проводилась со скоростью перемешивания 400 об/мин и с подачей воздуха в количестве 15 л/мин, за пенообразованием ведется контроль добавлением небольших количеств подсолне ьного масла или иных силиконсодержащих пеногасящих средств. рН 20 л культурального раствора добавлением соляной кислоты доводят до 5,0 и после отделения мицелия цолучают 18 л культурального фильтрата. Бутаноловый экстракт культурального фильтрата концентрируют под вакуумом в соотношении 1 10 от исходного объема и соединяют с бутаноловым экст рактом концентрата мицелиевого экстракта. Предварительно мицелий дважды перемешивают с метанолом в соотношении

1:6. Объединенные вытяжки под уменьшенным давлением концентрируют до 1/20 объема метанола, а образовавшийся при этом водный раствор исчерпывающим образом экстрагируется бутанолом. Соединенные бутаноловые экстракты вместе с бутаноловым экстрактом культурального фильтрата доводят до 1/25 объема куль турального раствора. Иэ конечного концентрата получают при добавлении трехкратного объема петролейного эфира 300 г биологически активного сырьевого продукта (А 6844) на 1 м культуральной среды.

Пример 3. 200 r сырьевого продукта А 6844 суспендируют в 5 л хлороформа и после 1 час перемешивания раствор отделяют от нерастворимого ос»

4$ татка. Хлороформенный раствор промывают пять-шесть раэ половинным объемом воды и тем самым полностью освобождают от водорастворимых пигментов. После высушивания хлороформенный раствор кон$6 центрируют под уменьшенным давлением до 1/50 исходного объема и перемешивают с десятикратным количеством петрэлейного эфира. При этом выпадает биологически активная фракция А виоламицина.

$$

Фракцию А отфильтровывают, промывают чистым петролейным эфиром и высушива ют под уменьшенным давлением и в экси

М. Дранишников

Т ехр ед М Петко

Корректор М. Beãóäà

Редактор Д. Пинчук

Заказ 292,3/22 Тираж 525 Подписное

0НИИПИ Государственного комитета СССР

° по делам изобретений и открытий

113035, москва, Ж-35„Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", r, Ужгород, ул. Проектиая, 4

11

66 г каторе над концентрированной серной кислотой. Выход фракции A составляет 16 г.

Фракцию А виоламицнна разделяют хроматографичеСки на колонне на антиби" отик виоламицин А и биологически недеятельный хромоформный комплекс виоламицинон А. Из 10 г виоламицина фракции

А получают 5 r виоламицинв А.

Фракцию В виблвтмийяна следует получеть иэ промывной воды хлороформенного экЬтфактй после установки кислотности на уровне рН 8,5, экстрагированием бутанолом. После концентрирования бутанолового экстракта и после его смешива-ния с петролейным эфиром образующийся осадок отфильтровывают и высушивают.

Выход виоламицина фракции В составляет 25 г на 200 r сырьевого продукта

А 6844.

Фракция В, аналогично фракции А, может быть разделена на антибиотик виоламицин В и биологически недеятельный хромофорный комплекс виоламицинон В.

Из 10 r фракции В получают 9,5 r антибиотика виоламицинв В.

3724

Формула изобретения

Способ получения антибиотика путем культивирования продуцента StI eptomiCe9

Miotacens в жидкой питательной среде, s содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации и перемешивании с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, очисткой и хромвтографическим разделе1э нием его на активные компоненты, о тл и ч в ю шийся тем, что, с целью получения нового антибиотика виоламицина, активного против микроплазменных, виру ных и опухолевых заболеваний, в качест» ве продуцента антибиотика берут штамм

ЯЬчйр1оЫсев ч1ойасЕпЯ МЕТ 1А 6844 а культивирование проводят при 25-37 С в течение двух-шести лет.

Источники информации, принятые во

>е внимание при экспертизе

1.КгаМЯпФоч N.À etat. Actihomsces взМЬеЫ 1Ag QTltl-v1I QQ olAt47lotjcUs.

the 3оо ьаС оg Ankibioticus.Ser.o sot.

Х!И % 1, 1960.