Способ получения активированных носителей

Способ получения активированных носителей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

<3 „. беме ттвт,е,и . щы w -ю -вафой

, зееъив Hk ф

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Республик (>664468

l ч ф),)„ф.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к.авт. свид-ву (22) Заявлено 27. 05 ° 77 (21) 2491073/23-04 с присоелинением заявки М (23) Приоритет (5 I ) M. Кл. С 07 G 7/02

Государстевнный комитет по делам нзооретеннй н открытий

Опубликовано 30.06.81. Бюллетень Ж 24 (53) УДК 577.15. ,07(088.8) Дата опубликования описания10.07.81

А,И.Кестнер, Х.Я.Киппер, К,A.Êèâèñèëëà, Х.P-В.Егоров, А.Э.Зрин, А.К.Арен и Д,Я.Дайя (72) А вторы изобретения

Таллинский политехнический институт и Всесоюзный научноисследовательский институт прикладной биохимии

НПО "Биохимреактив" (7I) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЕЙ г

Изобретение относится к способу

I получения активированных водонераст- воримых носителей для иммобилизации белков. Иммобилизованные на таких сорбентах ферменты могут быть применены как химические реактивы и про мышленные катализаторы для проведе- - ния ферментативных реакций в химической, фармацевтической и пищевой отраслях IIpOMbIIIIJIeHHOCTA

Иммобилизация ферментов путем их

I0 присоединения к нерастворимым нбсйтелям.является одним из наиболее известных способ улучшения технологических показателей этих биокатализа1$ торов. Метод иммобилизации ферментов заключается в присоединении их к активированным носителям, причем свойства получаемых катализаторов во многом зависят от способа получения и активации носителя. В качестве. носителей часто используют органоминеральные материалы, в частности, покрытые полимерами пористые кремне2 земные материалы. Носители такого типа характеризуются хбрбшйми гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препаратов, свойства которых во многом. зависят от метода внесения и активации полимерного слоя на носителе.

Известен способ получения модифицированных твердых носителей путем покрытия поверхности носителя полимером, в качестве которого используют полиакролейн $1) . Слой полимера образуется на поверхности носителя в результате пропитывания носителя мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимеризация происходит на поверхности носителя. Иммобилизация фермента производится по реакцтти между альдегидными группами носителя и, аминогруппами фермента.

Такой способ позволяет получить иммобилизованные на органоминеральных носителях ферменты, однако он

64468 4

3 Ь ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами. Связывание ферментов через альдегиды не всегда позволяет получить активные препараты. Кроме того, получаемые линейные полимеры обладают значительной растворимостью и не скрепляют неорганическую струк туру носителя .

Известен также способ получения активированного твердого носителя, пригодного для приготовления водонерастворимых ферментных перпаратов.

На поверхности носителя в результате полимеризации образуется слой полимера (2), в качестве которого используют полиакролеин. Носитель (фарфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Homme- ризация происходит на поверхности носителя, В результате модификации носителя таким способом получают носитель со свободными альдегидными группами.

Иммобилизация фермента (трипсина, папаина) производится через реакцию альдегидных групп носителя с аминогруппами фермента.

Недостатком этого способа является малая операционная стабильность получаемых активированиых носителей. Покрытие неорганического материала линейными полимерами, образующимися при полимеризации винильнйх полимеров, не обеспечивает достаточную нерастворимость и, следовательно, стабильность получаемых фермент- . ных препаратов. Такой способ ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами, а связывание ферментов через альдегидные группы не всегда дает возможность получить активные препараты. Кроме того, способ не обеспечивает высокого содержания белка на единйцу носителя. При иммобилизации трипсина достигается связыванием 0,2 мг белка на 1 мл носителя.

Цель изобретения — повышение операционной стабильности носителей для иммобилизации биоактивных веществ.

Это достигается известным способом пблучения активированных йоаителей для иммобилизации белков путем покрытия пористого Георганического материала с диаметром пор 200-2000 А

55 пленкообразующим веществом, в ка-. честве которого используют эпоксидную смолу и отверждают ее на носителе полиэтиленполиамином или 1 6-гексаметилендиамином в соотношении эквивалентов эпокеидной смолы и амина

1:0,25 при 100-120оС в течение не менее 1 ч.

Способ осуществляют следующим образом. 5 вес. ч. силохрома или силикагеля смачивают 9 вес. ч.

1,7 эпоксидной смолы в ацетоне.

После выпаривания растворителя при

100ОС проводят затвердение полиэтиленполиамином или 1,6-гексаметиллендиамином посредством кипячения в их водных растворах в течение 1 ч (соотношение эквивалентов эпоксидУ" ной смолы и амина 1:0,25). Носитель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при 100 С. Получают носитель, содержащий на поверхности пор пленку с активными эпоксидными группами, способными к непосредственному присоединению биоактивных. веществ.

При таком способе можно провести полимеризацию при повышенной температуре, способствуя этим образованию поперечных связей между молекулами полимера, а также связей между полимером и поверхностью носителя. Образование в порах носителя полимерной пленки закрепляет структуру носителя, уменьшает нежелательное адсорбционное воздействие молекул фермен-, та с носителем и предотвращает вымывание фермента с носителя из-за растворимости кремнезема при рН 7 и вьппе.

Пример 1. Получение носителя, активированного эпоксидной смолой с последующим затвердением полиэтиленполиамином.

Для получения носителя проводят пропитывание кремнеземного материала раствором эпоксидной смолы и затем затвердение водным раствором поли" этиленполиамина, который берется в количестве 25% от эквивалентного количества эпоксидной смолы.

5 г силохрома или силикагеля смачивают 9 мл раствора 1,7 эпоксидной смолы в ацетоне. После выпаривания растворителя при 100 С проводят затвердение 15 мл водным раствором полиэтиленполиамина кипячением йрй 100ОС в течение 1 ч. Затем

664468

5 носитель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при

I QQO C.

Способность используемой эпоксидной смолы к привязыванию амина составляет 2500 мк экв/г (определена кипячением смеси смолы с избыт-. ком амина при 100оС в течение 1 ч и обратным тычрованием непрореагировавшего амина кислотой). 5 r но- <О сителя покрывается О,I53 r (9 0,017) смолы, способность к привязыванию амина которой составляет 383 мк экв/г (0,153 2500), и необходимое количество полиэтиленполнамина, содержащееся в 15 мл раствора, составляет 7,2 мл (0,25 ° 383 75).

Получают активированный носитель, содержащий на поверхности эпоксидные группы в количестве 65 мк экв на I г zo носителя (определено по способу, опи. санному в данном примере).

Пример 2. Получение носителя, активированного эпоксидной смолой с последующим затвердением 1,6- 25

-гексаметилендиамином.

Для получения носителя проводят пропитывание кремнеземфого материала раствором эпоксидной смолы и затем затвердение водным раствором 1,6- N

-гексаметилендиамина, который берется в количестве 25Х от эквивалентного количества эпоксидной смолы.

5 г силохрома или силикагеля смачи-вают 9 мл раствора 1,? эпоксидной з смолы в ацетоне. После выпаривания растворителя при 100 С проводят затвердение 15 мл водным раствором

1,6-гексаметилендиамина кипячением при IOO C в течение 1 ч. Затем носи- О тель фильтруют, промывают водой и высушивают в термостате при 100 С.

При использовании эпоксидной смолы со способностью к привязыванию амина 2500 мк экв/г необходимое количество I,б-гексаметилендиамина, содержащееся в 15 мл раствора, составляет 5,6 мг (0,25 383 58).

Получают активированный носитель, содержащий на поверхности эпкосидные группы в количестве 50 мк экв на 1 г носителя.

Пример 3. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, акФивированного эпоксидной смолой с последующим затвердением полиэтиленполиамином .

5 г актнвированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) смачивают 8 мл боратным буфером с рН 8,0.

Смесь перемешивают и вакуумируют

15 мин для удаления воздуха из пор.

Затем добавляют 5 мл раствора химотрипсина с концентрацией 40 мг/мл в боратном буфере с рН 8,0, перемешивают и выдерживают при 20ОС в течение 2 ч. После инкубации препарат промывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 M раствором хлористого натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы порциями. Объем промывных вод составляет 100 мл. Полученный иммобилизованный препарат хранят в боратном буфере в холодильнике.

Ферментативную активность пре-. парата определяли на 2 раствора казеина. Активность равнялась

39,7 E/ã. Стабильность препарата оценивали по остаточной активности после проведения промывки препарата 100 мл 2Х-ным раствором казеина рН 8,0 в колонке с диаметром 6 мм и высотой столба препарата 70 мм в течение 24 ч. После такой промывки сохранялось 29 от исходной активности.

П р и м е -р 4. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, активированного эпоксидйой смолой с последующим затвердением 1,6-гексаметилендиамином.

5 г активированного эпоксидной смолой носителя (пример 2) смачивают 8 мл боратным буфером с рН 8,0.

Смесь перемешивают и вакуумируют

15 мин для удаления воздуха из пор.

Иммобилизацию фермента проводят как описано в примере 3. Получают препарат химотрипсина с активностью на 2Х казеина 36,7 К/г. После промывки препарата 2 -ным раствором казеина сохранялось 20Х исходной активности. предлагаемый способ позволяет получать носители для иммобилизации биоактивных веществ с повышенной операционной стабильностью, в которых внутренняя поверхность пор покрыта слоем нерастворимого полимера, содержащего эпоксидные группы, дающие возможность иммобилизации ферментов в укрунненнолабораторном масштабе, в том числе и ферментов, нуждающихся в высоких значениях рН. май ". . 4" М -, ee

I цфис фФчс ф 4Ф " .4р

664468 8 о т л и ч а ю щ и И с я тем, что, с целью повышения операционной стабильности получаемых материалов, при покрытии пористого неорганического материала с диаметром пор

Ф

200-2000 А в качестве пленкообразующего вещества используют эпоксид-ную смолу и отверждают ее на носителе полиэтиленполиамином или 1,6-гексаметилендиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:0,25 при 100-120ОС в течение не менее 1 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент ФРГ У 2229298, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1974.

2. Патент Великобритании

М 1342186, кл. С 08 Н 1/02, опублик.

2о 1973 (прототип).

Такой способ дает возможность получить препараты химстриппина, сохраняющие активность при 4ОС в течение 1-2 месяцев, что является предпосылкой для достижения высокой операционной стабильности препаратов.

Данный способ позволяет по сравнению с известным способом связывать в 10-20 раз больше белка на едийицу носителя.

Формула изобретения

Способ получения активированных носителей для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособные группы, Составитель А.Бочаров

Техред С. Мигунова

Редактор С.Суркова

Корректор M.Äåì÷èê

Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 4508 17 Тираж 397

ВНИИПИ Государственного комитета СССР . по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5