Способ получения тромбо-резистентных полимерных материалов

Патент 666815

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

О т"; И Е

ИЗОЗРЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ю 666815

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 06.12.76 (21) 2430206/23-04 с присоединением заявки М(23) ПриоритетОпубликовано 05.12.79. Бюллетень № 45

Дата опубликования описания 10. 12.79 (51)М. Кл.

С 07 6г 7/02

С 08 F 12/08

Ьюуднрютеюнньй кюмнтют

СССР ню дюнам нэебретеннй н ютнрытнй (53 ) УД!(577. 15. ,07(088.8}

Л. И. Валуев, М. А. Аль-Нури, H. С. Егоров, Н. А. Платэ и В, В. Навроцкая (72) Авторы изобретения

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им. М. В. Ломоносова (71) Заявитель (54} СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОРЕЗИСТЕНТНЫХ

ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Изобретение относится к способу псьлучения тромборезистентных полимерных материалов, которые находят широкое применение в медицине для создания искусственных кровеносных сосудов, раз.5 личных деталей вживляемых в организм искусственных органов, катетеров, деталей аппаратов искусственное сердце и искусственное легкое ".

В литературе описаны различные способы получения тромборезистентных материалов на основе синтетических полимеров. Известны создании тромбореэистентных полимерных материалов регулированием гидрофильности и гидрофобнооти поверхности таких материалов, а так« же модификацией полимерных поверхностей природным антнкоагулянтом кровигепарином.

М одифицированные гепарином полимерные материалы получают путем ковалентного связывания гепарина с макромолеку. лами полимера или адсорбцнонной аммо2 билиэацией гепарина на поверхности полимерного материала ll), Для укаэанных способов характерны недостаточная тромборезистентность по-! лучаемых материалов, которые не способны воздействовать на уже сформировавшийся тромб.

Кроме того известен способ получения тромборезистентных полимерных ма-териалов иммобилиэапией на поверхности материалов фибринолитических и протеолитических ферментов, способных не только предотврашать образование тромба, но и гидролизовать фибрин с образованием растворимых продуктов. Так, поверхность искусственных кровеносных сосудов на основе поликарбоната, полиметилметакрилата и цоливинилхлорида сначала покрывают слоем графита, а затем на графит сорбируют урокиназу. Для предотврашения быстрого вымывания фермента с поверхности полимера под действием тока крови урокиназу сшивают глутаровым альдегидом (2). з 6668

Однако этот способ обладает отсутствием химической связи между молекулами фермента и полимерного материала, вследствие чего возможна десорбция фермента с поверхности полимера; отсут-; ствием действия урокинаэы на тромб (урокиназа как и другие протеолитические ферменты лишь активирует превращение присутствующего в живом организме неактивного профибринолизина в фибрийо- 10 ,лизин фермент, катализирующий растворение тромба); достаточно высокой прот олитической активностью урокинаэы, вследствие чего возможно растворение шва между искусственным и естественным 15 органом под действием этого фермента; трудностью стерилизации уже готового . полимерного изделия, так как s процессе стерилизации под действием химических или физических агентов возможна .20 денатурация. фермента с потерей его активНости.

Бель изобретения» повышение тромбореэистентности и уменьшение протео литической активности при иммобилизации и получение стерильных тромбореэистент ных полимеров, способных непосредственно и достаточно специфически воздействовать на процессы тромбообразования и фибринолиэа

Для этого предлагается способ подучения тромборезистентных полимерных материалов, заключаюшМся в том, что проводят лммобилизацию ацилированного ангидридом или хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолитического фермента, выделенного из АсМ-

wmsces ьрЬегоЯев шт. 1. в нрисутст-, вии ненасыщенного гидрофильного мономера под действием ионизирующего из40 лучения.

Иммобилизацию фермента проводят обычно в вакууме или в атмосфере инертного газа, например аргона или азота, облучением ионизируюшим излучением

45 полимерного материала, погруженного в раствор ацилированного фермента и гидрофильного мономера. Иммобилизацию проводят пр 0-60 С в суммарной дозе

0,1-10 - 4-1(Урад. Весовое соотношение

50 ацицированные ферменттидрофильный мономер 1:50-800.

Основной отличительный признак изобре тения - использование фибриолитического

55 фермента. Условия проведения процесса иммобилизации фермента (рН, темпера тура и соотношения реагентов) полностью обусловлены физико-химической и биоло

15 4 гической природой самого фермента и полимерного носителя и могут изменять ся в довольно широких пределах. Суммар ная доза облучения выбрана так что обес« печивает стерилизацию полимера, В качестве гидрофильного мономера предпочтительно применяют акРилами14 метскриламид, аксиатилметакрилат и т,п., а в качестве исходного полимерного материала - полиатилен, полистирол, поливинилхлорид, сложные полиафиры, полиметилметакрилат и т,п, Ацилированный фермент получают добавлением к раствору фермента с концен трацией 0,5-10 мг/мл ангидрида или хлорангидрида акриловой или метакриловой кислоты при рН 7,0 вЂ” 9,0, темпера туре 0-60 С и при мольном соотношении ферментайгидрид или хлорангидрид кислоты 1:10-500.

Стерилизация полимерного материала и повышение специфичности фермента по отношению к фибрину достигаются автоматически в процессе иммобилизации под действием ионизирующего излучения..

Пример 1. Ацилирование фермен та проводят при О С добавлением к раствору 20 мг фермента в 15 мл бикарбонатного буфера (pH 8,0) 0,03 г хлорангидрида акриловой кислоты После добавления всего количества хлорангидрида раствор перемешивают в течение 15 мин.

В полученном растворе растворяют 4 r акриламида.

В ампулу с раствором помешают предварительно обезжиренную диатиловым афиром полиатиленовую пленку толщиной

0,05 мм и площадью 10 см2.Ампулу ва

2 куумируют до 10 мм рт.ст, и эапаивают Ампулу облучают р èçëó÷åíèåì

Со (мощность дозы 10 рад/ч), дозой б

0,3 10 рад, Ампулу вскрывают в сте6 рильных условиях и облученную пленку промывают бикарбонатным буфером, Активность полученной пленки при использовании в качестве субстата 1 %-ного

; раствора казенна равна 9,6+0,3 мкг тнрозина/мин. Потерипротеолитической ифибринолитической активности фермента при облуче. нии раствора ацилированного фермента в отсутствие гидрофильного мономера и полимера дозой О,З. 10 рад составляют б

35 и 8 %, соответственно, При внесении полученной пленки на поверхность сгустка фибрина зона растворимости образуется за 7 мин. При добавлении тромбина к раствору фибриногена, нанесенному на поверхность полученной пленки, фибрин

15 6

Фибринолитическая активность пленки аналогична активности пленки„ полученной в примере 1.

Пример 6. Стадии ацилирования проводят по примеру 1, используя в качестве гидрофильного мономера 4 r метакрилами,м, а в качестве полимерного материала плетеную ткань из полиэтилен терефталата. Активность полученной пленки по отношению к казенну равна 15,3+

0,3 мкг тирозина/мин 5 см . Фибринолитическая активность пленки аналогична активности пленки, полученной в примере

Пример 7. Ацилцрование фермента проводят при 20 С добавлением к рао

0 твору 100 мг фермента в 10 мл фосфат ного буфера (рИ 7,0) 0,002 г хлорангидрида акриловой кислоты. После добав« пения хлорангиарида раствор перемешивают в течение 10 мин и; раствору добавля ют 5 г акриламида. Б полученный рас твор вносят пластину иэ полиметилметакрилата толшлной 3 мм диаметром 50 мм, -3 раствор вакуумируют до 5. 10 мм рт.ст, бО -. и облучают $ -лучами Со с суммар ной дозой 4 10 рад при 0 С. Актив6 (3 ность полученной пластины по казенну

10,1+0,3 мкг тироэпна/мин. Потери про теолитической и фибринолитической актив ности фермента прп облучении раствора ацилпровапного фермента B отсутствии акриламица к полимера дозой ff х 10 p%1 составляет 90 ц. 50%„соответствен-. но. Зона растворимости BpEi внесении пластины на поверхность фцбрина образуется за 15 мш„Превращение фцбриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пластины,не происходит, Пример 8. Ацплнрование фермента проводят при 60 С добавляя к раствору 10 мг фермента в 20 мл борат» ного буфера (рН 9,0) 0,1? г хлорангид рида акриловой кислоты, Сразу после добавления хлорангидрида к раствору добавляют 0,02 г акриламида. В полученный раствор вносят полипропиленовую пленку толшиной 0,1 мм и плошадью 10 см и раствор вакуумируют до 10 мм рт.ст. и облучают -лучами @Со с дозой 0,1)( 10 рад прц 60 С в течение 6 мин.

Активность полученной пленки по казенну

l1,4+0,3 мкг тирозина/мин. Потеря про теолитической, и фибринолитической активности фермента при облучении ацилированного фермента в отсутствии акриламида и полимера составляет 95 и 50%, соответственно. Зона растворимости при вне35

5 6668 не образуется. Пленка с иммобилизованныл1 ферментом хранится в течение 1 мес. при 20 С без потери активности фермен та, а при хранении в течение 1,5 мес теряет около 30% исходной активности.

Полученная пленка стерильна, о чем свидетельствует отсутствие помутнения бульона хотингера после инкубации пленки прй37 и 28 С в. бульоне в течение 2 сут, 10

Пример 2. Стадии ацилирования и иммобилизации фермента проводят по примеру 1, добавляя к раствору фермента

7 г акриламида. Активность полученной пленки по отноШению к каэеину равна 1

27,8+0,3 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пленки на поверхность фибрина образуется в течение

4 .мин, Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверх- 20 ности пленки не происходит, Пример 3. Стадии ацилирования и иммобижзации фермента проводят. по примеру 2, используя в качестве ацилируюшего агента 0,03 г хлорангидрида метакриловой кислоты. Доза облучения составляет 1 10 рад,. Активность полу6 ченной пленки по отношению к казенну равна 15,1+0,2 мкг тирозина/мин. Потери протеолитической: и фибринолитической10 активности фермента при облучении ацилированного фермента в отсутствие акриламида и полимерного материала дозой

1 10 рад, составляет 70 н 40 %, соответственно. Зона растворимости при внесений пленки на поверхность фибрина образуется в течение 5 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не про40 исхопит.

Пример 4. Стадии ацилирования и иммобилизации проводят по примеру 2, используя в качестве ацилируюшего агента 0,03 г ангидрида акриловой кислоты, 45 а в качестве исходного полимера полипропиленовую пленку толщиной 0,1 мм и площадью 10 см, Активность получен ной пленки по отношению к казеину рав на 14,7+0,3 мкг тирозина/мин. Фибри

50 нолитическая активность пленки аналогична активности пленки, полученной в примере 2, Пример 5. Стадии ацилирования и иммобйлиэации проводят по примеру 2, 55 используя в качестве гидрофильного мономера 2 г оксиэтилметакрилата, Активность полученной пленки по отношению к казенну равна 10, 1 0,2 мкг тироэина/мин, 7 6668 сенин пленки на поверхность фибрина образуется в течение 8 мини Преврашение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит. 5

Из рассмотренных примеров видно, что по предлагаемому способу получают стабильные и стерильные полимерные материалы, которые не только предотвраша ют образование тромба, но и катапизи- t0 руют растворение уже сформировавшегося сгустка фибрина без привлечения внутренних ресурсов организма. В данном случае эффект тромбореэистентности обуспов лен не активацией присутствуюшего в живом организме профибринопиэина, а непосредственным воздействием иммобипизованного фермента на процессы тромбообразования и фибринопиза. Кроме того> осуществление иммобилизации с помошью ионизируюшего излучении позволяет в значительной степени регулировать специфичиостьдействия иммоб щизованиого фермента по отношению к фибрину. Так при дозе .10 рад потеря фнбринолитической

6 активности составляет 40% от исходной активности, а потеря протеопитической активности составляет .70%. Последнее ! означает, что использование предлагаемого способа позволяет получать тромбо резистентные полимерные материалы с резко выраженными фибринолитическими

I свойствами, но пониженной протеопети- ческой активностью, то есть с понижеаной склонностью к гидропизу места соединения тромбореэистентного полимерного материала с естественной тканью. Дополнительный вклад в повышение тромборезистентности вносит гидрофипизация поверхности полимерного материала за

40 счет привитой сопопимеризации ненасыщенного гидрофипьного мономера, которая осу15 шествляется одновременно с процессом иммобилизации фермента.

Формула изобретения

1. Способ получения тромборезистентных полимерных материалов иммобилиза» цией на их поверхности ферментов, о тл и ч а ю ш н и с я тем, что, с целью повышения тромборезистентности и уменьшения протеолитической активности целевого продукта с одновременной.его стерилизацией, в качестве фермента используют ацилированный ангидридом или хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолитический фермент, выиииинный нз йище ннтнфсЮ з ЫОяМ шт, 1. и иммобипизацию ведут в присутствии ненасыщенного гидрофипьного . мономера под действием ионизируюшего йзпучеиия.

2, Способ по и. 1, о т л и ч а юm и и с я тем, что в качестве ненасышенного гид;.офильного мономера используют акриламид, метакрипамид, оксиэтипмет":крипат.

3. Способ по пиl о т и и ч а юш и и с я тем, что в качестве полимерного материала используют полиэтилен, полипропилен, полистирол поливинилхлорид, сложные попиафиры.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Полимеры в медицине. М., Мир, 1969, с. 126. .. 2.Kussегоw В.К., Za>rom RVL,ÌвЂ”

ctlots Q-Å-, Синтетическая поверхность покрытая ковалентно сшитой урокинаЗЬй. Trans. Abner, Bar,-gyp дг 1у сЫЙ . 3 Ае1 Oat Огqans,19,8,197у .ааототип).

Составитель Г. Коннова

Редактор Л. Письман Техред 3. Фанта,. К орректор Ви Синицкая

Заказ 7670/1 Тираж 5 13- Подписное

UHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„д, 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, уп. Проектная, 4