Способ выделения -амилазы

Способ выделения -амилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскии

Социалистические

Республик

С 12 D13/10 . с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет

Гооудоротееииый котеитет

СССР

Опубликовано 25,05.80. Бюллетень,% lg > (53) УДК 663. .53(088.8) по делом изобретений и открытий

Дата опубликования описания 19.05.80 (72) Авторы изобретения

Р:P% (".

А. И. Ка чепкина и Л. И. Орещенко (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛГНИЯ 4 -АМИЛАЗЫ

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промьгшленнести и может быть использовано для выделения грибной амилазы из раство1за нативной культурапьной жидкости.

Известен способ выделения 4 -амипазы из культуральной жидкости МрЕг зчИоб

oP3xQS предусматривающий ее обработку анионообменным гель-сорбентом, десорбшпо фермента в присутствии хлористого

ic натрия с последующим выделением фермента из эпюента Щ .

Однако при использовании анионообменного гель-сорбента (АГС) с сорбционной емкостью 3,05-3,09 мг экв/г, набухаемостью 8,4-11,4 мп/г в ОН-форме сорбштя сорбента из раствора составляет 6080%. используемый в качестве этпоента т

1С%-ный раствор хлористого натрия обес-20 печивает 63-83%-ную десорбшпо фермента кроме того, указанный гель-сорбент применяется для очистки фермента без его концентрирования.

Нелью изобретения является повышение выхода и получение более очитпенного пр впар ата.

Для достижения этой цели из анионообменных гель-сорбентов используют гельсорбент в Ст-форме, десорбцию фермента осуществляют ацетатным буфером рН 6,06,2, при этом концентрацию хлористого натрия устанавливают в пределах 0,51,0 М, а выделение фермента осутцествпяют введением хлористого кальция концентрацией 0,5-1,57 нри одновременном подкиспении полученной среды до р Н 6, 06,2 с последующим осаждением органичес» ким растворителем.

Способ выделения dl -амилазы из культуральной жидкости AsperpKus огыое включает в себя следующие этапы: сорбцию фермента на гель-сорбенте АГС-1а: десорбцию фермента с гель-сорбента АГС1 а: осаждение фермента из эпюата. лиьт фипьное высушивание препарата высокоочищенной Ф -амипазы.

Таблица 1

48-50

98-100

90-1 00

6683

Процесс осуществют следующим образом. . Культуральную жидкость при естественном значении рН 7,5-8,0 обрабатывают . в статических или динамических усповиях

5 . гель-сорбентом АГС-1а, синтезированном на основе поливинилового спирта, с сорбционной емкостью гель-сорбента 1,49 мь

° эквlг, набухаемостью 43,0 мп/г, в С .— форме, так как предварительные исследо- 0 вания показали, что гель-сорбент в С1фсрме проявляет высокую избирательную сорбционную способность к амипазе (см. т.абл. 1).

В качестве десорбента рекомендуется 1 М раствор ацетатного буфера рН 6,0; который обеспечивает десорбцию фермента на 90-100% при 10 кратном концентрировании раствора.

В целях восстановления активных групп гель-сорбента в раствор элюента одновременно вносят ионы хлора в виде натриевОй соли (1р0 М)о

Это дает воэможность использовать гель-сорбент 5-7 раэ без регенерапии

ere соляной кислотой, которая требует большой затраты времени для отмывки сорбента водой до значения рН 7,0.

Внесение ионов хлора в раствор элюента позволяет использовать его в после40 дующем цикле сразу после промывки водопроводной и дистиллированной водой до значения рН 7,0. Промывают гельсорбент водопроводной водой 5 раз (тремя объемами) и три раза дистиллированной водой (двумя объемами).

После 5-7 циклов использования про водится полная регенерация гель-сорбента щелочью (один раз 7%-ным и два раза 5% ным раствором) из расчета 3 объема щелочи на 1 объем смолы, затем от;50

48 4 мывают его водопроводной водой до рН 7,0 и обрабатывают раствором соляной кислоты (тремя объемами: один раз

7%-ным раствором и два раза 5%-ным раствором) с последующим отмыванием гель-сорбента водопроводной и дистиллированной водой до рН 7,0. Полная регенерация восстанавливает сорбпионные свойства гель-ссрбента, обеспечивая его

15-20-кратное испопьзование.

Пример 1 (контроль) . Испопьзуют гель-сорбент АГС в ОН-форме с сорбпионной емкостью 3,5 мг.экв/г, набухаемостью 8,4-1 1,4 мл/г. Элюируюший раствор 10%-ный хлористый натрий.

Объем культур альной жидкости LOO мл, амилолитическая активность 2,6 ед/мл: общая активность 260 остаточная активность 57. Сорбция достигает 78%.

Получают 100 мл элюата с активностью 1,68 ед/мл: общая активность

168. Общий выход 64%. Десорбция 83%.

Пример 2 . Проводят сорбцию амилазы из культуральной нативной жидкости в статических условиях на гельсорбенте АГС- а в С1-форме, сорбционная емкость 1,49 мг экв/г, набухаемость 43,0 мг/г.

Содержание гель-сорбента 2% по сухому весу. Амилолитическая активность культуральной жидкости 13,0-16,0 ед/мл:, рН 7,5-8,0. Обработка культуральной жидкости гель-сорбентом проводится в емкости, снабженной мешалкой. длительность сорбции 1 ч. Смола отделяется от раствора фильтрованием и снова переносится в емкость для проведения десорбции фермента.

В качестве элюента используется ацетатный буфер (1 М) в присутствии ионов хлора (1,0 NaCt ) рН 6,0-6,2. Количество элюента берут из расчета степени концентрирования фермента (в 3-10 раз меньше взятого на обработку раствора)., Йесорбция проводится также при перемешивании раствора в течение 45 мин.

Смолу отдегиют фильтрованием и промывают водой для последующего цикла.

Данные опыта сведены в табл . 2.

Таблица 2

16000 . 100 -О,142 100,7 14400 90 . 7

16,0

1,0

15,0

75000 98

35 0000. 98

48000 100

5,0

1 3.0

27,0

3,0

16,0

Пример 3; Проводят сорбцию амилазы из культуральной нативной жидкости на гель-сорбенте. АГС-ta в Ск-форме в динамических условиях: сорбционная емкость 1,49 мг-экв/г, набухаемость

43,0 мл/г.

Раствор культур альной жидкости (АС-20 ед/мл, рН 7,8) пропускают через колойку заполненную 40 r гель-сорбента, предварительно подготовленного к работе. Скорость пропускания раствора

1,,0 л/ч.

Пропускают 2,0 л культуральной жидкости из расчета, что COE по амилазе составляет 750-1000 ед АС/г, гельсорбента.

Сорбция достигает 100%. Десорбцию проводят ацетатным буфером (1 М) в присутствии ионов хлора (1,0 МйаС ), рН 6,0. Скорость десорбции 0,5 n/÷.

Степень концентрирования раствора6 раз.

Получено 334 мл элюата с активностью

120 ед АС/мл. Общий выход 98%.

Преимущество метода сорбции амилазы

45 на гельсорбенте АГС-I а заключается в том, что данный образец анионита позво-. ляет работать в промышленных условиях с нативными растворами культуральной жидкости без предварительного диализа, 50 обеспечивает концентрирование фермента за сч ет использования меньших

l,00 70,56 70560. 96 5

9,00 37,5 3411250 97 3

О, ЗЗ 131,0 43200 90 9 объемов элюента в 3-10 раз и приводит к 2- и З-кратной, очистке фермента по белку. Сорбция фермента составляет 98-100%, дессрбция

90- 1 00% Общий выход фермента после сорбции - десорбции 88- 98%.

Второй этап очистки включает в себя выделение фермента из элюата путем осаждения органическими растворителями.

Условия осаждения амилазы из элюатов, полученных с гель-ссрбента АГС-|а, следующие . о

Элюат охлаждают до -4 С, вносят ионы кальция (СаСГ ) в концентрации

0,5% и рН раствора доводят уксусной кислотой (0,5 Н) до значений 6,0-6,2.

Органические растворители - этиловый спирт или ацетон — охлаждают до (-110)(-15) С. Осаждение белка проводится о при непрерывном перемешивании раствора.

Расход спирта составляет 2,5 объема на 1 объем элюата. Потери при осаждении достигают 15-20%. Общий выход высоко- очищенного препарата от исходной актив ности составляет 75%. Полученные препараты проявляют активность 10000120000 eg AC/ã йри содержании белка 60%.

Расход ацетона 1,5 объема на 1 объем элюата. Получены препараты с активностью

7500-8000 ед AC/ã и с содержанием белка 56%. Выход активности 72%.. 668348

Таблица 3

Ацетон (25) 427500 41,0

324000

7900

Этиловыйй спирт (0,33) 44000

33000

75

1 2000

2,75

Составитель А. Качелкина

Редактор Е. Месропова Техред М. Кузьма. Корректор С, Шекмар

Заказ 2190/61 Тираж 522 Пбдпис но е

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ?K-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", r. Ума ород, ул. Проектная, 4 е

Таким образом, предлагаемый способ

I ,выделения с4 -амилазы позволяет интенсифицировать процессы очистки и концентри-2о рованы ферментов, увеличить выход фермента на стадии концентрирования до 8898% и обеспечить общий выход высокоочищенного препарата на стадии осаждения из элюата по отношению исходной активности культуральной жидкости 70-75%.

Формула изобретения зс Способ выделения И -амилазы из куль туральной жидкости Asperptlue or iae предусматривающий ее обработку анионообменным гель-сорбентом, десорбцию фермента в присутствии хлористого натрия с последующим выделением фермента из элюата, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и получения более очищенного препарата, из анионообменных гель-сорбентов используют гель-сорбент в С8-форме, десорбцию фермента осуществляют ацетатным буфером рН 6,0-6,2, при этом концентрацию хлористого натрия устанавливают в пре делах 0,5-1,0 М, а выделение фермента осуществляют введением хлористого кальция концентрацией 0,5-1,5% при одновременном подкислении полученной среды до рН 6,0-6,2 с последующим осаждением органическим растворителем.

Источники информации, . принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

¹ 319615, кл. С 08 Г 216/06, 1969.