Способ приготовления сорбента"
Патент 671385
Авторы
Способ приготовления сорбента"
Иллюстрации
Реферат
(11) ъ
О П И С А И- -"И"-""
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (б1) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 31.08.77 (21) 2523515/28-18 (5! ) Ч Кл. С 12 К 7/00 /
С 01 В 33/00 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритст— (43) Опубликовано 30.03.80. Бюллетень ¹ 12 (45) Дата опубликования описания 30.03.80
Государственный комитет (53) УДК 576.858 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения В. Н. Борисова, С. E Бреслер, Н. С. Головина, В. М. Коликов, И. В. Красильников, В. М. Молодкин, Л. М. Молодкина, Б. В. Мчедлишвили, Л. А. Нахапетян и Л. Б. Эльберт (71) Заявители Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, Ленинградский политехнический институт им. М. И. Калинина и Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СОРБЕНТА
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к технике приготовления сорбентов для очистки вирусных суспензий, используемых для изготовления вирусных антигенов и вакцин.
Известен способ приготовления сорбентов для очистки вирусных суспензий путем последовательной обработки поверхности макропористого кремнезема модификаторами с последующим промыванием сорбента !О ,и уравновешиванием буфером (1).
Однако сорбент, полученный известным способом, не обеспечивает высокого выхода из колонки некоторых вирусных препаратов .и необходимой чистоты очищаемого вирус- 15 ного материала вследствие недостаточно прочного связывания модификатора с поверхностью кремнезема. Кроме того, такой сорбент подвержен действшо протеаз, что вызывает загрязнение Виру сного прспграта 20 посторонними белками.
Цель изобретения — предупреждение попадания в вирусный препарат молекул биологически активного модификатора и повышение устойчивости сорбента к ферментативным воздействиям.
Указанная цель достигается тем, что поверхность макропористого кремнезема модифицируют последовательной обработкой 1 — 10%-ным раствором гамма-аминопро 30 пилтриэтоксисплана и 1 — 5%-ным раствором глутарового альдеп1да, затем полученный сорбент промывают дистиллированной
Водой и влажный сорбент смешивают в равных количествах с 0,5 — 1,5 M раствором трис(-оксиметпл-) ампномстана.
Способ осуществляется следующим образом.
1 объем макропористого кремнезема обрабатывают 1 — 10%-ным раствором гаммааминопропплтрпэтокспснлана в ацетоне, затем высушивают и смешпва1ОТ с 1 объемом
1 — 5 0-ного раствора глутарового альдегида. Полученную суспензию персмешивают в течение 1 ч, после чего кремнезем отфильтровывают и промывают дистиллированной водой. Затем 1 объем влажного кремнсзсма смешивают с 1 объемом 0,5 — 1,5 М раствора трис-НС! буфера. После 2-часового псремешпванпя в трис-HCI буфере кремнезем отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, уравновешивают нужным буферным раствором и загружают в колонку.
Затем суспензпю, содержащую вирус, Вносят В ГотОВ) 10 хРОз1атог1 афическУ10 колонку и элюпруют через колонку с помощью буфера, которым колонка предварительно уравновсшена. Элюат из колонки собирают во фракции, которые в дальней671385
60 шем анализируют на содержание вируса и примесей белка., Пример 1. К 60 см макропористого стекла (МПС-1000) прибавляют 60 мл
1 — 10 /о -ного раствора гамма-аминопропилтрпэтоксисилана в ацетоне, хорошо перемешивая, высушивают на воздухе, а затем в сушильном шкафу при 110 С в течение
6 ч. Концентрацию аминогрупп на поверхности такого стекла определяют в пределах
О,I — 1,2 мг - эквlг. К обработанному таким образом стеклу прибавляют 90 мл 0,25 М фосфатного буфера (рН 7,0) и 10 мл 25О/оного водного раствора глутарового альдегида и перемешивают 1 ч при комнатной температуре. К промытому водой стеклу прибавляют 100 мл 1 М трис-НС1 буфера (рН 7,0), полученную суспензию перемешивают 2 ч, промывают водой и загружают в хроматографическую колонку (0,9><14 см) .
После заполнения сорбентом колонку уравновешивают элюирующим буфером. Элюентом может служить 0,05 — 0,1 М фо"фатносолевой буфер с содержанием 0,1 — 0,2 М хлористого натрия.(рН 7,4 — 8,0) или 0,05—
0,1 М трис-буфер с 0,15 М хлористого натрия (рН 7,5 — 8,0). Скорость элюции можно изменять в пределах 0,1 — 4,0 см/мин,.
Культуральную жидкость, содержащую вирус клещевого энцефалита (шт. «Софьин» или «Пан»);или суспензию вируса гриппа (шт. МРЦ 11) объемом 0,2 — 1,0 мл вводят в колонку и элюируют буфером, которым колонка уравновешена. В 4-м — 5-м мл элюата выходит очищенный вирус. Белковые примеси выходят из колонки. в 8-м—
10-м мл элюата и не содержат практически вирусной активности. Выход вируса из колонки зависит от концентрации групп трис(-оксиметил-) аминометана на поверхности кремнезема. И в оптимальном случае (0,3—
0.4 мг экв/г) выход как вируса клещевого энцефалита, так и вируса гриппа составлял
90 — 100О/О от вирусной активности, введенной в колонку.
П ри м ер 2. К 25 мл силохрома С-80, обработанного предварительно растворами гамма-аминотриэтоксисилана и глутарового альдегида, как описано в примере 1, приливают 25 мл 1 М трис-НС1 буфера (рН 6,85) и перемешивают в качалке 2 ч при комнатной температуре. После отмывки дистиллированнои водой полученный сорбент уравновешивают в элюирующем буфере и загружают в колонку (0,8х12,0 см). В эту колонку вводят 0,5 — 1,0 мл суспензии вируса клещевого энцефалита или вируса гриппа и проводят элюцию. Элюентом являются буферные растворы, приведенные в примере 1. В 3-м — 4-м мл элюата выходит
100 /о вирусной активности, внесенной в колонку. Примесные белки и низкомолекулярные вещества элюируются в 7-м и 8-м мл
l0
Пример 3. Макропористое стекло (МПС-1000), модифицированное трис (-оксиметил-) аминометаном с содержанием на поверхности модификатора 0,4 мг экв/г, подвергают последующему восстановлению, которое проводят следующим образом.
К высушенному модифицированному, как описано в примере 1, стеклу добавляют 60 мл дистиллированной воды и 60 мл
0,1 /о -ного раствора ХаВН4 и в течение
30 мин интенсивно перемешивают. Затем обработанное таким образом стекло отмывают дистиллированной водой, уравновешивают элюирующим буфером и загружают в колонку (0,8х12,0 см). Через колонку пропускают суспензию с активным;или инактивированным формалином вирусов клещевого энцефалита объемом 0,5 — 1,0мл. Условия элюирования аналогичны условиям, приведенным в вышеописанных примерах. Выход как активного, так и;инактивированного вируса из колонки составляет 100 /о.
Модификация макропористых кремнеземов трис(-оксиметил-) аминометаном делает возможным их использование для гельф ильтрационной хроматопрафии вирусных суспензий. Такой способ приготовления сорбента устраняет адсорбцию вирусных частиц на поверхности макропористого кремнезема и позволяет производить без потерь очистку вирусного материала.
Использование в качестве модификатора трис(-оксиметил-) аминометана не вызывает загрязнения очищаетмых вирусных препаратов биологически активными молекулами, так как он не является биологически активным веществом (он входит,в состав кро веза менителя) .
Данный способ получения сорбента технологически несложен. Полученный сорбент отличается постоянством свойств и долговечностью за счет химического связывания . молекул триса с поверхностью стекла, Модифицированный трис (-оксиметил-) аминометаном кремнезем не подвержен воздействию различных ферментов, содержащихся в суспензиях вирусов. Это расширяет возможности применения сорбента, полученного данным способом, в частности, делает его пригодным для применения в хроматографии различных ферментов.
Формула изобретения
Способ приготовления сорбента для очистки вирусных суспензий путем последовательной обработки поверхности макропористого кремнезема модификаторами с последующим промыванием сорбента и уравновешиванием буфером, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью предупреждения попадания в вирусный препарат молекул биологически активного модификатора и повышения устойчивости сорбента к фермент т т тт тт ттт ттт тттт т ттттт т тт ттттл ттт тттттт ттттт т т as a sssan
671385
Составитель В. Головин
Техред В. Серикова
Корректор С. Файн
Редактор E. Месропова
Заказ 229/335 Изд. № 233 Тираж 522 Подписное
НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
П3035, Москва, Л(-35, Раушская наб., д. 4/5
Тип. Харьк. Фил. пред. «Патент» пористого кремнезема модифицируют последовательной обработкой 1 — 10% -нымраствором гамма-аминопропилтриэтоксисилана и 1 — 5%-ным раствором глутарового альдегида, затем полученный сорбент промывают дистиллированной водой и влажный сорбент смешивают в равных количествах с 0,5 — 1,5 M раствором трис(-оксиметил-) аминометана.
Источник информации, принятый во
5 внимание при экспертизе:
1. Сборник трудов ИП и ВЭ, М., 1972, с. 18 — 19.