671738 - Способ получения биомассы микроорганизмов

Способ получения биомассы микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

П И С А Н И Е, 67) ДЯ

Союз Советсиих

Сои(иапйстический "

Республик

К fIATEHTV (6!) Дополнительный к патентувЂ” (22) ЗаявлЕно 1 80274 (21) 1997527/28-13 (23) Приоритет вЂ” (32) 20. 02. 73

2 (51) М. Кл.

С 12 0 13/10 (3!) 8198/73 (33) Великобритания

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий

Опубликовано 30 ° 06 79 Áþëëåòåíü № 24

Дата опубликования описания 05 ° 07 79 (,53) УДК 557 ° 15 . (088.8) Иностранцы

Дэвид Эрнест Форестер Гаррисон, Джон Гарри Харвуд, Барри Нейл Герберт и Стюарт Джозеф Врен (Великобритания) (72) Авторы изобретения.

Иностранная фирма Шелд Интернэшнл Рисерч Маатсхаппий Б.В. (Нидерланды) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

1, Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается техники получения биомассы путем куль.тивирования микроорганизмов, потребляющих метанол, Наиболее близким решением к описываемому изобретению является изBecтный способ получения биомассы микроорганизмов путем культивирова-ния бактерий рода Pseudomonas, усваивающих метанол, в анаэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей метанол, способный к ассимилляции, источник азота и необходимые минеральные соли (1).

Однако такой способ дает недостаточно высокий рост микроорганизмов и низкий выход биомассы.

Целью изобретения является увеличение роста микроорганизмов и выхо- да биомассы.

Поставленная цель достигаетоя опИ- сываемым способом получения биомассы микроорганизмов, в котором в качестве микроорганизмов, усваивающих метанол, используют штамм Pseudomonas NC3B Р 11040,. культивированиекоторого осуществляют в. присутствии штаммов микроорганизмов, не усваивающих метанол: Pseudomonas НСЭВ

Р 11019, NC3B Р 11022, Acinetobactex

NC 3B Р 1 1020 и Cur tobac ter ium NC3B

Р 11021, Новый вид бактерий содержит больше протеина, а наличие в среде микроорганизмов, неусваивающих метанол, в. смеси с микроорганизмами, усваивающими метанол, приводит к появлению синергического эффекта, за счет которого р увеличиваются скорость роста и выход микроорганизмов по сравнению с условиями, в которых осуществляется культивирование только одних микроорга-,, .низмов, усваивающих метанол. !

Б Способ осуществляют следующим .образом.

Иэ природных источников выделяют (выделение и характеристика приведены в примерах 1 и 2) смешанную куль20 туру DMS 72, состоящую иэ усваивающего метанол штамма Pseudomonas NC38

Р 11040 (EN) и чЕтырех не.усваивающих метанол микроорганизмов! двух иэ рода Pseudomonas NCQB вЂ” Р 11019 (MU)

25 и Р 11022 (ЭЬ), штаьма из рода Acinetobacter NCJB Р 1102 (GR) и штамма из рода Curtobacterium НС7В

Р 11021 (FG) .

Жидкая среда для выращивания

З0 культур содержит от 1 до 200 г/л ме-.

Питательная среда может также со.держать следы других элементов в виде солей, например, кальция, марганца, цинка, к обальта, молибдена, или бора. Примеры питательных сред приведены в примерах 1 и 4.

Процесс можно осуществлять периодически, полунепрерывно или непрерывно. Когда процесс проводят непрерывно, то его можно начать согласно периодической схеме или с использованием более быстрой йачальной стадии. При достижении равновесного со.стояния из питательной среды постоянно выводят микроорганизмы, в то время как постоянный объем культуры поддерживают путем постоянного добавления свежей питательной среды.

В непрерывном процессе концентрацию метанола во вспыливающей жидкости растущей культуры поддерживают на уровне роста независимо от количест ва метанола в среде, питающей культуры, и эта концентрация должна находиться предпочтительно на низшем . уровне, йе превышающем 0,01% об/об.

Микроорганизмы выращивают в бродильном сосуде, например, в annapat те с перемешиванием или с раэбрызгивателем, которые снабжают внутренним или внешним охлаждением. Аэрацию культуры осуществляют при помощи воздуха, кислорода или обогащенного кислородом. вбздуха.

Температуру культуры поддерживают

30-50ОС, преимущественно 38-45 C рН среды вЂ” в пределах 6,0-8,0, предпочтительно 6,4-7,4, путем добавления щелочи, например, NaOH, КОН, NH ОН

4 кислоты, например, H SO, H PO4 .

Микроорганизмы извлекают из питательной среды одним иэ стандартных методов, например, флоккуляцией, седиментацией или осаждением с послетавола, предпочтительно oT 20 до

100 г/л.

В среде также имеются азотсодержащие соединения вЂ” такие, как аммиак, аммониевые соли, а также сульфа.ты или хлориды, нитрат, нанрймер щелочногого металла, или мочеви на. Концентрация азотсодержащего соединения колеблется в пределах 3-50 г/л.

В питательной среде могут.присутствовать также фосфор, сера, магний и железо. В качестве источника фосфора используют фосфаты, например, К2НРО4 Р КН2Р04 11а2 НРО4 ° .ИаН2Р04 или (NH4 ) HPO HJIH фос форн jIQ концентрация которых находится в пре .делах 3-20 г/л. Источником серы может "служить серная кислота или сульфат (ИН4)2 ЯО4концентрацией 0,5-, 5,0 г/л. Металлы присутствуют в виде солей, например, NgSO4. 7Н20 (концентрация О 2 2 О г/л) и FeCI> 6Н О (концентрация 0,01-0,1 г/л).

671738 4 дующим центрифугированием или фильтрацией. Биомассу затем высушивают и используют в качестве источника протеина для пищевого сырья для животных и человека.

Пример 1. Выделение смешан8 ных культур.

Извлечение смешанных культур

;)МЯ 72 иэ соответствующего сырья. Пи тательная среда, используемая в этом методе, обозначается как DCRZ и име10 ет следующий состав, г/л:

Метанол 5,0-50,0

НРО4 3 i 000

КН2РО4 3i000

4-)2 4 4 5-9,0

)8 Na -цитрат 0,125

MgSO4 " 7Н20 0 500

ГеСХ3 6Н20 0,167

CaCI2 Н20 0,660

ЕпЯО4 7Н20 0,180

СыЯО4 7Н2 О 0,160

МПЯО4 ° 4Н2О О, 150

CoCI2 бн О 0,180

Н ВО

0,100

Na2MoO4 2Н О О, 300

Вода

До 1 л рН среды поддерживают 6,8 путем добавления щелочи, например, гидроокиси натрия.

Лабораторный бродильный чан (рабочий объем 2,4 л) с DCRZ средой при

42 С и рН 6,8 .подвергают вэбалтывао нию и проводят барботаж воздухом (2 л/мин) . Затем проводят инокуляцию

100 г образца ила, полученного из потока сточной воды из выпускного оТверстия в Sittingbourne, Англия, и добавляют метанол с концентрацией

0,5 об./об. Если наблюдают интенсивное помутнение культуры, добавляют еще метанол (0,5 об./об.), При даль40 нейшем увеличении помутнения в бродильный чан непрерывно подают DCRZ среду, содержащую 1 об./об. метано-4 ла, при скорости разбавления 0,08 ч, При достижении равновесных условий, 45 определяемых при помощи постоянной величины оптической плотности культуры, скорость разбавления постепенно увеличивают до 0,2 ч . Таким образом выделяют культуру, обозначенную .ЭМЯ 72.

Пример 2, Выделение и иден-, тификация типичной смешанной культуры (ЛМЯ 72)

1 мл образца культуры ЭМБ 72, 58 полученной по способу примера 1 из1 влекают из бродильного чана, помещают в маленькие стеклянные бутыли и разбавляют питательной средой

DCRZ, не содержащей метанол, до Концентрации 10, 10 или 1 О, По 0,1 мл

60 образцов извлекают из бутылей и поме.щают на агаровые пластинки с пита тельной средой DCRZ u Lab Lemco. Каждую пластинку накрывают колпачком, на который (в случае пластинок с

DCRZ) наносят небольшие количества

738 6

Пять микроорганизмов, выделенных из 3MS 72, подвергают серии испытаний (1-30 в табл. 1) для определения, к какому виду микроорганизмов они относятся.

Результаты испытаний предс1авлены в табл. 1, .где (+) обозначает положительную реакцию в опыте, а (-) обозначае1 отрицательную реакцию.

Ка основании этих результатов четыре микроорганизма классифицируют следующим образам:

MU Pseudomonas sp. (NC3В Р 11019);

FG Curtobacterium (NC3B 9 11021);

Э? Pseudomonas (NCQB В 11022);

GR Acinebacter (NC3B Ф 11020);

Таблица 1

Испытание

+/- переменна я

Окраска по Граму

Палочка

Палочка иконок

Палочка Палочка

Форма

Споры

Пигмент ровный светложелтый на крахмальном агаре

Серый

Я(елтый

Диффузия пигмента

Подвижность

Рост на воздухе

Каталаза

Оксидаза

Глюкоза (кислота) Слегка

V +

Окислительный

Слегка V+

Слегка

V +

Слегка

V +

Слегка

V +

Hughu Leifson ,(OF испытание)

Рост на агаре

МС Сои Кеу

Окислительный

+ через 7 дней

Рост на питательном arape

Рост на бульоне KCN

Питатель- Питатель- Питательный агар ный агар ный агар

Зависимость роста от температуры, о С

Рост на метиламине

Гемолиз (кровяной агар) 5 671 метанола. Пластинки затем перевертывают и термсстатируют при 42 С 48 ч.

Обследование пластинок rio истечении этого времени показывает, что только один вид микроорганизмов (обозначенный ЕИ) вырос на пластинках с ПСКОВ и что четыре вида микроорганизмов 5 (обозначенные MU, FG, Л, GB) вырастают на пластинках c (as 1 emco. Используя петлю из платиновой проволоки, отдельные колонии каждого микроорганизма переносят на новые пластин- 1ð

- ки, содержаыие соответсвуюцую пит ат ельную среду, с цен ью получения чистых культур каждого вида.

Питатель- DCRZ + 0,5%ный агар . ный метанол

671738

Микроорганизмы не усваивающий метанол

Испытание

3L С

Лизин декарбоксилаза

Слегка +

Орнитин декарбоксилаза

Слегка Переменный +

Нет роста

Обесцвечив ание

Обесцв ечивание ч-слегка + не испытано

Потребление цитрата +

Гидролиз крахмала

Восстановление нитрата +

Нет роста

Рост на церине (кислота) Слегка +

Рост на ксилозе (кислота) На основании полученных результатов нельзя классифицировать усваива.вЂ” ющий метанол микроорганизм EN (NC3B

Р 11040).

Реакцию ми к роорга ниэмов на ряд других известных антибиотиков определяют в нескольких опытах. Результаты испытаний представлены в табл. 2.

Таблица 2

Антибиотик

Новобиоцин

Олеандомицин

Сильно S

Канамицин

Сульфаметоксазолтриметоприм

Ампилиллин

Налйдиновая кислота

Линкомицин

Аргинин дигидролаза

Гидролиз желатина

Обозначение индола

Voges Pros Kauer

Образование Н S

Образование мочевин

Лев оми це ти н

Э ри тром ици н

Сульфафуразол

Пенициллин G

Стрептомицин

Тетрациклин вЂ” -"---Цефалоридин

Продолжение табл. 1

671738

Продолжение табл. 2

Антибиотик

Фураэолидон

Нитрофурантоин

Метициллин

Неомицин

Окситетрациклин

Фуэидиновая кислота, R S

Клоксациллин

Колистин метан

Полимиксин

Карбенициллин

Гентамицин

Сильно S Сильно S

R S

Сильно S S

S S

П р и м е ч а н и е: S вЂ” чувствительный, R вЂ” стойкий

1) ОП = 1,70

ii) ОП = 2,05

iii) ОП = 0

i) ОП= 0

ii) = 0,55

11i) ОП = 0,06

Пример 3. Опыты с использо- ванием усваивающего метанол микроор- 30 ганиэма EN DMS 72, Установка состоит из Н-образной трубки, разделенной на две части диализной мембраной, размещенной в горизонтальной секции трубки. Обе части трубки наполняют 25 мл DCRZ среды и 0,2%-ным метанолом. В первой части трубки проводят три отдельных опыта:

i)инокулЯциЯ микроорганизмов EN; 40

ii) то же;

iii) контроль вЂ” без инокуляции.

Во второй части трубки также проводят три опыта:

i) контроль вЂ” без инокуляции;

ii) инокуляция смесью не усваивающих метанол микроорганизмов вЂ” MU.

FG, 32, GR;

iii)òî же.

В каждом эксперименте получены следующие данные по конечной оптической плотности.(ОП):

Часть I трубки Часть II трубки

Результаты опытов указывают на то, что наибольший рост микроорганиз- 60 мов наблюдается, когда EN выращивают в контакте со смесью не усваивающих метанол микроорганизмов MUg РО, 3Q, GR. Данные также показывают, что вещество, выделяемое микроорганизмом 65

EN способно диффундировать через делительную мембрану и поглощаться микроорганизмами MU FG ЭБ, GR, i. Чистые усваивающие метанол микроорганизмы выращивают во вэбалтываемой колбе с 500 мл среды DCRK u

0,1% об./об. метанола, содержащего меченые атомы С"4 . Колбу затем термостатируют при 42 С на ротационном шейкере с орбитальным радиусом 2,5 см при 20 С. Образующуюся двуокись углерода абсорбируют гранулами гидроокиси натрия, помещенными в трубке, подсоедийенной к колбе. Через два дня оптическая плотность культуры остается постоянной, что свидетельст,вует об окончании роста, а в жидкости культуры не остается метанола.

Культуру затем центрифугируют при

10 000 об/мин и всплывающую жидкость стерильно фильтруют;

ii. 100 мл этой всплывающей жидкости инокулируют 1,0 мл культуры

JMS 72, а затем культуру выращивают во взбалтываемой колбе по способу, описанному выше.

На каждой стадии (1) и (ii) измеряют радиоактивность, обусловленную присутствием С"4; в начале опыта; в образовавшихся микроорганизмах; в всплывающей жидкости в конце; в образовавшемся СО

На стадии (11) метанол отсутствует и рост микроорганизмов обусловлен ростом не. Усваивающих метанол микроорганизмов в JMS 72. Результаты опытов видны из следующей схемы.

671738

Метанол 1 О г

Стадия 1

0,36 г (сух.вес) усваивающих метанол микроорганизмов (сух.вес) вающих метанол организмов

Общая биомасса О

Таблица 3

Скорост бавле ч ание на, Ъ

76, 25

79,97

77, 50

0,310

0,400

О, 065

0,162

О, 430

0,232

0,319

79,37

О, 490

О, 460

0,364

О, 426

0,470

О, 450

О, 507

О, 537

Вымыто

0,545

О, 589

0,638

0,660 микроорганизмом приведены в вающнм метанол

FG. Результаты табл. 4, Таким обра з ом, рост не усв а ив ающих метанол микроорганизмов способствует увеличению общего выхода био- массы. Веществ о, выделяемое усв аив аюййми йетанол микроорганизмами и необходимое для роста микроорганизмов, не усваивающих метанол, представляет собой углеродный субстрат.

Пример 4. Непрерывная культура ЗМЯ 72. Семйлитровый бродильный сосуд с рабочим объемом 4,2 л загружают DCRZ средой, содержащей 4„0 г/л метанола,, и инокулируют 100 мл культуры ЭМЯ 72, которую предварительно термостатируют при 42 С в течение одного дня. рН среды поддерживают на

Вышеописанный эксперимент повторяют, используя усваивающий метанол микроорганйзм ЕБ и смесь EN с не ус0,08 r углерода в всплывающей жидкости !,409 г (сух.вес) уровне 6,8, а температуру вЂ” 42 С, Культуру перемешивают при 1000 об/мин и аэрируют со скоростью 1 л/ч. Начало брожения проводят по периодической схеме до получения оптической плотности культуры 1,5 (625 мм) .

Непрерывную культуру получают при скоростй разбавления от 0,5 до0,66 ч.

Равновесное состояние поддерживают, по крайней мере, два дня при каждой скорости разбавления, исключая 0,66 ч.

Культуру в общем выдерживают 700 ч, Коэффициенты выхода биомассы и данные о содержании протеина в биомассе полученной при каждой скорости .разбавления, приведены в табл. 3.

76, 88

80,60

78, 75

68, 12

66,88

671738

Таблица 4

Продолжение табл. 5

Аминок

6,21

0,35

0,06

5,72

0,29 0,29

0,10

0,29

1,92

0,12!

0,29

1,85

4,46 5, 01

0,13

0,35

7,71

2,97

7,95

3,46

0,16.

0i30

Вымыто -- вЂ” О, 35

0 19

3,93 3,96

0,24

Вымыто

2,21

2,17

7,30 6,68

1,75

2,05

Аргинин

4,98

5,00

Аминокислот

9,41 9,67

Аспарагиновая

Треонин

Серии

Глутаминовая

Пролин

Глицин

Алании

4,60

4,29

3,18 3,33

9,84 10,13

2,73

3,17

5,63

6,78

7,00

92,4

15 22 25 750

0,06

94,5

94,8

5 17 21 740

0,10

0,20

5 13 15 600

Иэ сравнения данных в табл. 3 и

4 можно сделать вывод, .что смесь ЕЙ со всеми четырьмя не усваивающими метанол микроорганизмами дает более высокий выход биомассы на 1 г метанола, чем культура чистого EN, или культура, содержащая EN и только один из этих не усваивающих метанол микроорганизмов. Использование JNS

72 позволяет также проводить процесс при более высоких скоростях разбавления.

Данные о содержании аминокислот в )М$ 7.2 и EN приведены в табл. 5.

Т а б л и ц а 5 3

Валин

Цистин ()

Метионин

Изолейцин

Лейцин

Тироэин

Фенилаланин

Аммиак

Лизин

Гистидин

Данные табл. 5 показывают, что присутствие не усваивающих метанол .микроорганизмов в ЛМЯ 72 не влияет .существеннр на содержание аминокислот в продукте.

Пример 5. Соотношение микроорганизмов в ОМЯ 72 при получении непрерывной культуры.

Непрерывную культуру 5NS 72 получают аналогично примеру 2. Во время опыта определение количества бактерий посевом на агар в чашках Петри проводят при каждой скорости разбавления для установления относительных размеров популяций различных микроорганизмов. Образцы культуры, взятые из бродильного сосуда, разбавляют стериль.ным солевым раствором (0,85%-ным) до концентрации 0,1 мл х 10 /х 10 и х 10 и по 0,1 мл разбавленных растворов помещают на высушенные двойные Lam .фенсо пластинки. Пластинки термостатируют при 42 С, а затем подсчитывают колонии различных типов микрооргани змов .

Результаты представлены в табл ..6.

Та блица б

Скорость разбавления, ч

96,0

4 8

3 5

12 580

0,30

96,9

10 570

0,40 !

0,50

97,6

3 4

8 600

2 3: 1 600

99,2

0 55

Время после инокуляции, ч

Скорость . эбавления, ч"

0- 20

2,0-16,0

0,22 быстрая начальная стадия

0,12

20-190

18,0

20,0

190-240

240-265

265-340

0,17

0,33

21,5 22,0

27,4

0,04

3 40-570

0,08

Данные табл. б показывают, что во всех случаях большая часть биомассы состоит из усваивающего метанол мик роорганизма EN. Процетное содержание не усваивающих метанол микроорганизмов колеблется в зависимости от скорости разбавления от 0,8 до 7,6% от суммарной культуры.

Пример б; Непрерывная культура ЭМЯ 72 с использованием быстрой начальной стадии.

Среда, применяемая в этом опыте, имеет .следующий состав, г/л:

Иа2НР04 . 3,000

KHz Р04 3,000 (ИН4)д ЯО4 20,000

MgS04 ° 7Н20 0,750

РеС?2 6Н20 О, 167

Метайол

80 (мг/л)

CaCI2 Н20 5,300

ZnSO4 ° 7Й20 1,400

СаЯ04 . 5H О 1,300

Пример 7, Сравйительные ис следования..

Периодически полученную культуру микроорганизма выращивают в 2,41 л среды DCRZ, содержащей 1,5% метанола, в 3-литровом лабораторном бродильном сосуде при 42 С (беэ стерилизации после инокуляции), После достижения плотности клеток 3,0 г/л

671738 16

Продолжение табл. б

MnSO4 4Н О - 1,200

15 СаСТ2 6Н О 1,400

Н Во 0,800

На2Мо04 ° 2Н20 .. 2, 400

Вода До 1 (л)

Семилитровый бродильный сосуд заг-, ружаютт 4,2 л питательной среды, а затем инокулируют культурой 3МЯ 72, В начальной стадии получают концентрацию сухого веса клеток равную

16 г/л, 25 . Концентрацию метанола затем увеличивают ступенчато (приращение

1,0 г/л) до получения концентрации" сухого веса" клеток 25 г/л в следующих условиях опыта: температура 42 С, 30 рН 6,6 (контролируют KOH), перемешивание при 1500 об/мин, аэрация

51 л/мин, скорость разбавления 0,070,3 ч ", Результаты опыта приведены в табл ° 7 °

Т а блица 7

Ь (сух.вес) непрерывную культуру полу-1 чают при скорости разбавления 0,05 ч.

В течение двух дней в культуре появ о ляется.споронесущий микроорганизм, и культуру промывают.

В случае использования смешанной культуры ЛМЯ 72, споронесущий микроорганизм не появляется в культуре

300 дней, Данные опытов показывают, Формула изобретения

Составитель А, Бражникова

Техред О.Андрейко Корректор А. Гриценко

Тираж 525 Подписное

Редактор E. Хубларова

Заказ 3940/61

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, E-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

17 . 671 что смешанная культура имеет большую стойкость к инфекции, чем чистая культура усваивающего метанол микроорганизма.

Непрерывно получают культуры микроорганизма EN 2,41 л среды DCRZ, содержащей 1Ъ метанола, при рН 6,8 5 и 42 С. Наблюдается пенообразование, достигающее размеров, требующих добавления кремнийосновныХ противопенных агентов три раза в течение 6 дней.

В случае проведения опыта с ис- 10 пользованием JMS 72, введения противопенных агентов не потребуется в течение 100 дней °

Способ получения биомассы микро органиэмов путем культивирования бактерий рода Pseudomonas усваивающих

738 18 метанол, в анаэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей метанол, способный к ассимиляции, источник азота и .необходимые минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью увеличения роста микроорганизмов и выхода биомассы, в качестве микроорганизмов, усваивающих метанол, используют штамм Pseu-.

domonas NC3B Р 11040, культивирование которого осуществляют в присутствии штаммов микроорганизмов, не усваивающих метанол: Ряеийотопая АСОВ

Р 11019, NCpB Р 11022, Ас1пе1оЬас1ег

NCGB Р 11020 и Curtobacterium NC3B

М 11021.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Патент Великобритании

Р 1270006, кл. С 6 F 1972.

Способ получения биомассы микроорганизмов

Патент 671738