Способ иммобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале

Способ иммобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Реслублмк

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22) Заявлено15,12.75 (21) 2300323/23-04 с присоединением заявки РЙ (51)M. Кл.

С 07 (л 7/02

С 07 F 7/08 (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам нзооретений и открытий (53) УДК547.245. .07 (088.8) Опубликовано05.07.79. Бюллетень J% 25

Дата опубликования опмсания08.07.79

А. А. Чуйко, В. А. Тертых, E. И. Федорченко, В. В. Янишпольский, А, С. Цыперович, И. П. Галич и Т. А. Ковальчук (72) Авторы изобретения

Институт физической химии им. Л. В. Писаржевского (71) Заяв„тел,„АН Украинской CCP и Институт биохимии им. А. В. Палладина

АН Украинской CCP (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТА

НА КРЕМНЕ ЕМСОЛЕРЖАЩЕМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к улучшенному способу иммобилизации фермента на кремнеземсодержашем материале, используемого в пищевой и химической промышленности, а также в медицине.

Иммобилизация ферментов позволяет

5 продлить их активность и сделать пригодными для регенерации и повторного использования. Одним из способов иммобилизации ферментов является их ковалентное

10 присоединение к носителям, которые могут быть как органическими, так и неорганическими. Последние обладают большей структурной стабильностью, мало чувствительны к изменениям рН среды и к микl5 робиальным атакам.

Известен способ иммобилизации фермента, заключающийся в том, что кремнеземсодержащий носитель обрабатывают орр носиланом для введения функциональной группы, через которую носитель связывается с ферментом посредством поперечнс сшивающего агента (1). Связывание осуществляют путем добавления этого агента к смеси раствора фермента с модифицированным носителем. В качестве поперечносшивающих агентов используют альдегиды и галоидные соединения дисульфонила.

Недостатком известного способа является то, что при добавлении поперечносшивающего агента последний может не только соединять фермент с носителем, но и осуществлять сшивание молекул самого фермента, что приводит к снижению ферме нтативной активности получаемого продукта до 30 ед/г. Кроме того, предлагаемые поперечносшиваюшие агенты могут обеими функциональными группами реагировать с привитыми к поверхности группами, что приводит к уменьшению количества связанного белка (до 2%).

По технической сущности к предлагаемому способу наиболее близок способ иммобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале путем взаимодействия кремнеземсодержащего материала, модифицированного аминопропилтриалкоксиси672203 ланом, с поперечносшиваюшим агентом, например с тиофосгеном, в среде орг нического растворителя с последующей обработкой полученного продукта буферным раствором фермента при рН 9 (2).

Однако обработка крем:.еземсодержа5 щего материала, модифицированного аминопропилтриалкоксисиланом, тиофосгецом

- длится около 4 ч,и вследствие невысокой активности изотиоцианатных групп после10 дующая иммобилизация фермента на носителе длится около 2 ч.

Целью изобретения является упрощение процесса за счет сокращения времени ре1 акции.

Цель дос.игается тем, что кремнеземсодержащий материал, модифицированный аминопропилтриалкоксисиланом, подвергают взаимодействию с поперечносшиваюшим агентом, а именно с 2,4-толуилендииэоцйанатом, в среде органического растворителя с последующей обработкой полученного продукта буферным раствором фермента.

Отличительным признаком предлагаемого способа является использование в качестве поперечносшивающего агента

2,4-толуилендиизоцианата.

Носителем могут быть кремнеземсодержашие вещества, предпочтительно вещества с большой удельной поверхностью, например высокодисперсная двуокись крем- ния.

Носитель обрабатывают органосиланом для введения в поверхность реакционноспособных аминогрупп. Подходящим органосиланом является " -аминопропилтриэтоксисилан и ему подобные.

Затем такой носитель обрабатывают

2,4-толуилендииэоцианатом с целью введения изоцианатных групп, способных в мягких условиях быстро взаимодействовать с ферментом. Благодаря различной активности иэоцианатных групп 2,4-толуилен- 45 диизоцианат взаимодействует с носителем более активной группой в положении 4.

При этом изоцианатная группа в положении 2 остается на поверхности свободной и способна взаимодействовать с амино- 50 группами белка. Мольное отношение 2,4-толуилендиизоцианата к концентрации аминогрупп на поверхности носителя составляет 0,8-0,9:1,0. При меньшем отношении уменьшается количество связывае- 55 мого фермента, а при большем - носитель становится гидрофобным и плохо смачивается водой.

Предлагаемый способ может быть использован для связывания ферментов через их аминогруппы, поэтому- предпочтительно применять те ферменты, в которых аминогруппы не имеют существенного значения для проявления их активности.

Пример. 25 г высушенного при

400 С в течение 2 ч аэпосила с удельЯ ной поверхностью 175 м /г размешивают в 250 мл толуола и к смеси добавляют

S,6 г )" -аминопропилтриэтоксисилана.

Смесь кипятят с обратным холодильниКоМ при перемешявании в течение 2 ч, промывают избытком толуола и высушивао ют в вакууме при 110 С. Концентрация аминогрупп на поверхности полученного аминоорганокремнеэема, определенная потенциометрическим титрованием хлорной кислотой, составляет 1 ммоль/г.

2,5 г аминоорганокремнезема размешивают в 25 мл четыреххлористого уг лерода и к смеси добавляют раствор

0,39 г 2,4-толуилендиизоцианата в 25 мл четыреххлористого углерода. После полного перемешивания смесь промывают избытком четыреххлористого углерода и вы» сушивают в вакууме при комнатной тем пературе. Полученный активированный Но» ситель используют непосредственно для связывания фермента или хранят в ампулах, запаянных в вакууме.

0,25 г фермента-<-амилаэы, содержащей 96-98% белка и обладающей амилолитической активностью 280000 ед/г, растворяют в 10 мл 1 М фосфатного буфера с рН 7,0, Затем при медленном перемешивании к раствору быстро прибавляют 1 г активированного носителя, Связывание осуществляют при комнатной тем» пературе в течение 10 мин. Далее иммобилизованный фермент поочередно промывают 1 М фосфатным буфером с рН 7,0. и 0,005 М раствором ацетата кальция с рН 5,5 (по 200 мл) до исчезновения амилолитической активности в промывных жидкостях. Полученный продукт высушивао ют при 4, С и при этой же температуре хранят в сухом виде.

Высушенный продукт содержит 8-12 белка и обладает амилолитической активностью 800-1250 ед/г.

Формула изобретения

Способ иммобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале путем

6722

S взаимодействия кремнеземсодержашего матер иала, модифиц ирова н ного ами нопропилтриалкоксисиланом„с поперечносшивающим агентом в среде органического растворителя с последуюшей обработкой полученного продукта буферным раство-,. s ром фермента, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью упрошения процесса, Оз в качестве поперечносшиваюшего агента берут 2,4-толуилендиизоцианат.

Источники информации, принятые во внимание при эксперт изе

1. Патент США % 36698 1, 195-63, опублик. 1972.

2. Патент США М 3519538, 195-63, опубли к. 1968.

Составитель О. Минаева

Редактор 3. Бородкина Техред И. Асталош Корректор

Заказ 3827/25 Тираж 5 1 2 Подпис ное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж.-35, Раущская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4