Способ получения биомассы микроорганизмов

Способ получения биомассы микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

OilÈÑÀÍÈÅ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

< и 676177

Союз Советских

Социалистических

Республик (6! ) Дополнительный к патенту (51) М. Кл.

С 12 D 13/06 (22) Заявлено 120376 (21) 2331955/28-13 (23) Приоритет — (32) 14 ° 03 ° 75 (31) 10745/76 (33) Великобритания

Опубликовано 250779.Бюллетень №27

Дата опубликования описания 25.07,79

Государствеимый комитет

СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15 (088. 8) (72) Авторы Иностранцы изобретения Дэвид эрнест Форестер Гаррисон (Великобритания) и Харманнус Иоханнес Доддема (Нидерланды) Иностранная фирма (71) Заявитель шелл интернэшнл Рисерч маатсхаппий Б.В. (Нидерланды) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к способам получения биомассы микроорганизмов, представляю цих собой микроорганизмы, которые способны усваивать газообразные органические соединения, содержа5 щие один или более атомов углерода, например метан.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному способу является способ получения биомассы мик10 роорганизмов, предусматривающий культивирование в аэробных условиях в присутствии газообразного метана на жидкой питательной среде, содержащей источники азота и минеральные соли, метаниспользующего микроорганизма в присутствии штамма Pseudomonas NC1B

911112, которые культивируют в присутствии по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штамма

Pseudomonas N С1В 911062, 911063 или

911065 и Mycobacterium N ClB 911061, при этом температуру культивирования поддерживают в пределах 30-60 С и рН среды 6,0-8,0 (1).

Недостаток способа состоит в том, что он осуществим лишь при участии всех упомянутых видов микроорганизмов.

Преимуществом предлагаемого способа является применение потребляющего метан микроорганизма MethyIococcus

999 N C1B 911083 в способе получения одноклеточных протеинов как без, так и с добавлением других микроорганизмов.

Цель изобретения — повышение выхода биомассы.

Это достигается тем, что в качестве метаниспользующего микроорганизма применяют штамм MethyIococcus 999

N C1B 911083, а также тем, что процесс культивирования ведут в присутствии штамма Pseudomonas NC1B

911112 и/или по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штаммов Pseudomonas N C1B 911062, 911063 или 911065 и Mycobacterium N

С1В 911061, при этом в процессе культивирования температуру поддерживают в пределе 30-60"С.

Сущность способа состоит в том, что для получения биомассы использу ют как смешанные культуры, полученные следующим путем, так и чистые культуры этого штамма:

А. Смешанные культуры, включающие в себя метанпотребляющие микроорганизмы с одним или более видом (штаммом) 676177

Таблица 1

seudomonas Mycobacte

С1В 911062 NC1B 9110

Показатели

Окраска по

Грамму

Форма

Стержни

Спорообраэование

С помощью полярных жгутиков

Подвижность

С помощью полярных жгутиков

С помощью полярных жгутиков

Продуцирование каталазы .

Активность оксидаэы

Использование глюкозы

Испытания О-F (Хью и Лейфсон) Окислительная

Окислительная метанолпотребляющих микроорганизмов и одним или более видом (штаммом) неметилотрофных микроорганизмов.

В предложенном способе они определены как Т4 и представляют собой следующие культуры MethyIococcus 999 N

С1В 911083, Pseudomonas N ClB Ð11112, Mycobacterium N С1В 911061 и три штамма Pseudomonas N C1B 911062, 911063 и 911065.

Б. Штамм MethyIococcus 999 NC1B

911083 также хорошо растет на метане в присутствии одного или более неметилотрофных микроорганизмов беэ добавления метанолпотребляющих микроОрганизмов метаболизма штамма MethyIococcus 999 NC1B 911083.

Если в качестве источника азота используют мочевину, то выращивание штамма MethyIococcus 999 ведут в присутствии положительных к уреаэе неметилотрофных микроорганизмов.

Смешанная культура Т4, выделенная из взятой с фермы тропических уток унавоженной земли, предпочтительна для осуществления способа.

Из смешанной культуры Т4 техникой перекрытых слоев выделяют штамм

MethyIococcus 999 NClB Ð11083 со следующими характеристиками.

Тип перегородки: N трубчатая перегородка, кокки, ди аметр клетки около 0,9 мм, рост при температурах 37„

42 и 55 С и на метаноле.

Сформулированные капсулы.

Цвет колонии: белый/коричневый.

5 Чувствителен с антибиотикам: сульфафураэолу 100 мкг, пенициллину G

1,5 единицы, стрептомицину 10 мкг, тетрациклину 10 мкг и ампициллину

2 мкг.

Характеристика штамма Pseudomonas

NClB 911112.

Характерисзуется способностью к росту и образованию колоний только на агаровых пластинках, содержащих

15 метанол в качестве единственного источника углерода.

Не растет в присутствии глюкозы, лактозы, сахарозы,маннита, инозита, цитрата или питательного агара..

Размер примеРно 2 мк в длину и

1 мк в ширину с одним полярным флагеллумом.

Колонии на агаре — гладкие и серые с целыми краями, образуются на

„агаровых пластинках с метанолом и минеральными солями после инкубациИ в течение 2 дней при 42 С.

Характеристика идентифицированных штаммов приведена в табл.1.

676177 ь

Продолжение табл . 1

Кислотный фест

Н е т

Активность уреазы

Использование цнграта

Гидролиз желатина

Продуцирование индола

Метилкрасный и проба Воже-Проскауэра

Реакции (в кислой среде) на: глюкозу сахарову маннит мальтозу

Рост на питательной среде

Каталазная активность

Восстановление гидрата

Слабое

Слабое

Способ получения биомассы осуществляют предпочтительно при непрерывном культивировании. для роста микроорганизмы засевают в жидкую питательную среду, которую 45 контактируют с газовой смесью, содержащей метан и кислород. Метан может быть подан в виде природного газа.

Свежую среду непрерывно подают в культуру со скоростью 0,02-1,00 объ- 50 ема в 1 ч и культура выводится с такой скоростью, чтобы объем культуры оставался постоянным.

Газ подают в виде пузырьков. Источником кислорода служит воздух, 55 чистый кислород или обогащенный кисhopopoM воздух.

Отработанный газ отводят иэ верхней части ферментера, и он может быть замкнут в цикл. 60

Температура. культивирования 3060 С, предпочтительно 38-50 Ci рН культуры предпочтительно 6,0-7,0.

Клетки микроорганизмов отделяют от культуральной жидкости любым стандартным методом.

Биомассу высушивают вымораживанием или распылительной сушкой и используют как протеиновую пищу или пищевую добавку для людей и животных.

Пример 1. Непрерывную культуру как смешанной культуры Т4, так и чистой культуры NethyIococcus 999

NC1B 911083 выращивают в стерильных условиях в ферментерах с механическим перемешиванием и рабочим объемом 2,5 л.

Смесь метана и воздуха в соотношении 2:1 барботируют через жидкость со скоростью 900-1200 мл/мин.

Температура культуры 42 С при рН

6,8, регулирующемся автоматически добавлением смеси 0,5 МаОН и 0,5 KOH.

Культуру перемешивают со скоростью

V 200 об/мин. Свежую среду подают и отводят непрерывно, поддерживая постоянный объем.

Состав среды в концентрации, ммоль . (ННц)@SOö — 11,0; Н РОч — 10,0;

MgSO< — 0,4; CaCI< — 0,1; FeSO<

33 х 10 у ЕпБОц — 1,0 х 10 з, NnSO

676177

1,0 х 10 СцБО

0,2 х 10 ; KI

1,0 х 10

10 х 10, Н ВО

0,5 х 10 ; Иа МоОц

0,5 х 10; Н БОц

Таблиц а 2

Культура

Максимально достигнутая скорость разбавления, ч 1

0,71

Т4

2,42

0,34

NethyIococcus

999 NC1B

911083

2,14

0,31

0,66

Колбы инокулируют 1,5 мл свежего

25 инокулума. Среда следующего состава, г/л: КН РО, — 1,6; ИадНРОц — 1,16, (ИНэ) СΠ— 2,0," М9БОц 7Н О вЂ” 0,08;

РеБОц ° 7Н О вЂ” 0,014; Са(КО )д. 4H„-O

0,025; СцБОц 5Н О вЂ” 4-10 ; 2пБОц 7Н О30 — 3,4 10 "; МпБОц 4Н О вЂ” 3 10 ";

Иа NoO 2Нэ Π— 2, 4 10

Количество среды 300 мл.

Рост Nethylococcus 999 NCIB

911083 и смешанной культуры оценивают путем измерения оптической плотности при 625 нм (значения величины для одной из трех кУльтУР)

Полученные результаты приведены в табл.3, Т а б л и ц а 3

Культура амма за период, ч

MethyIococcus 999 (чистая) NethyIococсцэ 999 (смешанная с положительными к уреазе бактериями) Положительные к мочевине бактерии характеризуются следующим образом: грамм штамм +, форма — палочки, неподвижные, рост на воздухе +, каталаэе +, оксидазе -, кислой глюкозе (гаэ) +, ОГ (Науа апд Ее1fson) +, уреаэе +, нет денитрификации.

Результаты показывают, что МеЖуIococcus 999 NC1B 911083 хорошо растет только на мочевине, если присутствуют положительные к уреазе микроорганизмы.

Каждый ферментер засевают 1,00 мл культуры, выращенной в колбах для встряхивания, один — смешанной культурой Т4, а остальные — чистой культурой Nethylococcus 999 NC1B 911083.

Пример 2 ° Культивируют штамм

Nethylococcus 999 (один) и смесь этого штамма с положительными к мочевине бактериями, не способными к росту на метане, но способными к росту на веществах, производимых микроорганизмом Nethylococcus 999.

Культивирование ведут при 42 С в солевой среде в стерильных стеклянных сосудах емкостью 500 мл.

Метан, воздух и углекислый гаэ пропускают со скоростью 25, 100 и

10 мл соответственно через фильтр из спеченного стекла.

Среду подают в ферментеры в интервале скоростей разбавления 0,100,2-0,3 ч до тех пор, .пока культура не начнет вымываться из сосуда.

Установившееся состояние поддерживают для каждой скорости разбавления по крайней мере в течение 48 ч.

Полученные результаты приведены в табл.2.

Концентра-, Выход, г суция сухой хого васа/г массы, г/л СНц (использованного) 0,005 0,005 0,029 0,054

0,005 0,229 О, 490 0,550

Пример 3. Смешанную культуру

Т4 выращивают на различных источниках азота в различных условиях °

Культивирование ведут аналогично примеру 1. Условия культивирования:

60 температура 42ОС, рН 7,0, скорость разбавления 0,18 ч, скорость перемешивания 100 об/мин, общая скорость потока газа 600 мл/мин °

Выход рассчитывают по анализу газового потока на входе и выходе из ферментера с помощью газовой хрома676177

10 тографии и с учетом измерения скорости потока газа. Определяют концентрацию сухой массы микроорганизмов, которая находится между 4 и 5 г/л, по разнице концентрации углерода между образцом культуры и культурой, всплывшей после центрифугирования образца

6000 r в течение 15 мин.

Содержание углерода в клетках, высушенных в сушильных шкафах, равно

48%.

Использованная среда содержит, г/л: КНгРОч — 1,60; ИагНРОч 1,16;

МцЯОч 7Й гΠ— 0,080; ГеЯОч ° 7НгО

Показатели

Источник азота

NaNO

3:1 6:1 .Зг1 б:1

3:1

Предельный фактор роста

Ог СНч О СНч

0,65 0,63 0,09 0,83

+0,03 +0,03 +0,04 +0,02

Выход, г клеток/г

0,76

СН„ т0,05

Продолжение табл.5

Пример 4. Штамм Methylococ

cus 999 NC1B Р11083 и культуру смеси

Т4 выращивают как в примере 1 при скорости разбавления 0,08 ч на среде следующего состава, г/л: КНгРОч

1,бу Na НРОч — 1,16; NaNOa — 3,18;

M@SO q 7Й,Π— 0,107; РеЯО„ 7HzO—

0,009; CuSO „ 5HzO — 3.10 "; Ca(NO>)z

° 4Н О вЂ” 0,06; ЕпЯОч.7Н, Π— 3,6,1&;

MnSOv 4HzO — 5 10; NaZMoOv ° 2НгО—

3,1 ° 10 "; CoCIz 6НгΠ— 1,5 10 ".

Клетки из культуры, выводимой на- 40 сосом иэ ферментационного сосуда, собирают, центрифугируют и сушат вымораживанием.

Содержание протеина в обоих случаях равно 69%.

Результаты аминокислотного анализа клеток из культуры Т4 и штамма

999 приведены в табл.5 °

Таблица 550

7,39

6,53

5,41

4,68

7,66

6,32

6,31

5,99

0,57

2,32

2,59

3,83

4,21

7,28

7,30

2,17

3,97

4,65

Фениланин, 4,59

Орнитин

0,05

0 18 диэин

5,24

5,49

Аргинин

Ги стиди н

5,63

5,04

2,02

2,06

8,55

8,29

Аспаргиновая

Треонин

Серии

4,42

4,34

3,49

3,40

Подав аемое соотношение воздух/метан в газе

О, 014 р Ca (NO>)z 4НгΠ— О, 025 2

CuSOu 5HzO — 2,4.10 ; ЕпЯОч 7НгО

3, 4; MnSO <. 4НгΠ— 3, О 10 ;

Nap1oOv 2НгΠ— 2, 4 10 "; CoCI> ° 6Н40

1,5 10 ".

Добавляют концентрированную серную кислоту (36 н.) в количестве

0,33 мл/л.

В качестве источника азота добавляют 3,18 г/л NaN03, 2,46 г/л (ННч) ЯОч или 1,122 г/л (МНг) СО °

Влияние источника азота и предельного фактора на непрерывное культи вирование смеси Т4 показано в табл .4.

Т аблиц а 4

Пролин

Глицин

Аланин

Валин

Цистин

Метионин

Изомицин

Лейцин

Тирозин

N/D

Формула изобретения

1. Способ получения биомассы микроорганизмов, предусматривающий куль6761

Составитель И.Привалова

Редактор Т.Загребельная Техред Л.Алферова . корректор Е.Лапп

Заказ 4362/54 Тираж 525 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэооретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент r.ужгород, ул.Проектная,4 ти вирование мет анисполь эующего ми кроорганиэма в азробных условиях в присутствии газообразного метана в жидкой питательной среде, содержащей источники усвояемого азота и необходимые минеральные соли, о т л и ч аю шийся тем, что с целью увеличения выхода биомассы, в качестве метаниспольэующего микроорганизма применяют штамм Methylococcus 999 NC18

911083.

2. Способ по п,1, о т л и ч а ю - 10 шийся тем, что процесс культивирования ведут в присутствии штамма

77 12

Pseudomonas NC1B 911112 и/или по мень шей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штаммов Pseudomonas

NC1B 911062 или 911065 и ИусоЬас1е -, rium NC18 911061.

3. Способ по п.1 или 2, о т л и ч а ю шийся тем, что в процессе культивирования температуру поддерживают в пределе 30-60 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Заявка 92090249/13 кл. С 12 П 13/06, 1974, по которой принято решение о выдаче патента.